Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos
Summary
Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.
Abstract
A hepatectomia parcial tem sido amplamente utilizada para investigar a regeneração hepática em camundongos, mas o isolamento de altos rendimentos de hepatócitos viáveis para aplicações unicelulares a jusante é um desafio. Um acúmulo acentuado de lipídios dentro de hepatócitos em regeneração é observado durante os primeiros 2 dias de regeneração hepática normal em camundongos. Esta chamada esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à principal fase proliferativa. A purificação do gradiente de densidade é a espinha dorsal da maioria dos protocolos existentes para o isolamento de hepatócitos primários. Como a purificação do gradiente depende da densidade e do tamanho das células, ela separa as populações de hepatócitos não esteatóticos dos esteatóticos. Portanto, hepatócitos gordurosos muitas vezes são perdidos, produzindo frações de hepatócitos não representativas.
O protocolo apresentado descreve um método fácil e confiável para o isolamento in vivo de hepatócitos regeneradores, independentemente de seu conteúdo lipídico. Hepatócitos de camundongos machos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente, usando uma técnica de perfusão retrógrada com saída pela veia porta. Os hepatócitos são dissociados pela colagenase para sua liberação da cápsula de Glisson. Após a lavagem e centrifugação cuidadosa, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante. Em conclusão, este trabalho descreve uma técnica simples e reprodutível para o isolamento de uma população representativa de hepatócitos regenerados após hepatectomia parcial em camundongos. O método também pode ajudar no estudo da doença hepática gordurosa.
Introduction
O fígado pode regenerar-se mesmo após uma grande perda de tecido. Essa capacidade regenerativa única é explicitamente ilustrada pelo modelo experimental de hepatectomia parcial (70%), descrito pela primeira vez em ratos por Higgins e Anderson em 19311. Neste modelo, 70% do fígado é removido cirurgicamente dos animais, cortando lobos hepáticos maiores. Os lobos restantes crescem então através de hipertrofia compensatória para restaurar a massa hepática original dentro de cerca de 1 semana após a cirurgia, embora sem restauração da arquitetura hepática original 2,3. Hepatectomias adicionais com quantidades variadas de remoção tecidual têm sido desenvolvidas, como a hepatectomia prolongada a 86%, onde o remanescente hepático é muito pequeno para se recuperar, levando eventualmente à insuficiência hepática pós-hepatectomia (PHLF) e subsequente morte em 30%-50% dos animais 4,5,6. Esses modelos possibilitam o estudo da regeneração hepática normal e falha, dependendo da quantidade de tecido ressecado (Figura 1).
Embora os modelos de hepatectomias em camundongos tenham sido usados com sucesso por muitos anos, apenas recentemente métodos analíticos mais avançados permitiram uma visão mais profunda no nível de célula única. Para a maioria desses métodos, no entanto, a presença de hepatócitos individuais é um pré-requisito básico. A maioria dos protocolos para o isolamento de hepatócitos primários baseia-se em uma técnica de perfusão de colagenase em duas etapas e subsequente purificação de gradiente de densidade para separar hepatócitos viáveis de detritos e não parenquimatos, bem como células mortas 7,8,9. Esse método foi descrito pela primeira vez por Berry e Friend em 196910 e adaptado por Seglen e colegas em 197211,12. No entanto, como a centrifugação por gradiente depende da densidade e do tamanho das células, os hepatócitos carregados de lipídios são frequentemente perdidos durante a purificação padrão. Embora essa perda possa ser insignificante para muitas questões de pesquisa, é um aspecto crucial para a regeneração hepática precoce. Durante os primeiros 2 dias, os hepatócitos dentro do fígado de rato em regeneração acumulam lípidos, crescendo assim em tamanho e mergulhando em densidade. Essa esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) serve para fornecer combustível regenerativo e é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à fase proliferativa principal e é distribuída de forma desigual dentro dos lóbulos hepáticos – as unidades funcionais do fígado13,14. Após a hepatectomia prolongada de 86%, no entanto, a SRAT também ocorre, mas persiste, pois a regeneração é paralisada e os lipídios não estão sendo oxidados14. Portanto, a purificação gradiente de hepatócitos após hepatectomias de 70% ou 86% produzirá frações não representativas, pois a maioria dos hepatócitos carregados de lipídios é perdida devido à sua baixa densidade15.
Neste protocolo de isolamento modificado, hepatócitos de camundongos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Normalmente, a canulação e a perfusão do remanescente para isolamento celular são feitas através da veia porta. No entanto, a resistência portovascular em pequenos remanescentes deixados após ressecção maior é alta16 e, portanto, a perfusão é delicada. Como a veia cava permanece não afetada pelas hepatectomias, a perfusão pode ser facilmente realizada na direção retrógrada através da canulação da veia cava. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente hepático, utilizando perfusão retrógrada com saída pela veia porta (Figura Suplementar S1). Os hepatócitos são dissociados pelas colagenases e liberados da cápsula de Glisson. Após a lavagem e o processamento cuidadoso de hepatócitos viáveis por isolamento gradual usando uma abordagem de centrifugação de baixa velocidade, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo publicado fornece um método confiável e direto para isolar um alto rendimento de hepatócitos murinos normais e esteatóticos para análises a jusante de célula única ou análise em massa de células após a classificação FACS. A vantagem distinta sobre a purificação do gradiente de densidade é que o conteúdo lipídico celular não tem essencialmente impacto no rendimento efetivo dos hepatócitos. Assim, a fração de hepatócitos esteatóticos será retida e incluída nas análises a jusante. Isso …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Swiss National Fond (bolsa de projeto 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
