Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu
Summary
Lipid yüklü hepatositler karaciğer rejenerasyonuna özgüdür, ancak genellikle yoğunluk gradyan santrifüjleme ile kaybolurlar. Burada, steatotik hepatositleri tutan ve farelerde parsiyel hepatektomi sonrası rejenere hepatositlerin temsili popülasyonlarını veren optimize edilmiş bir hücre izolasyon protokolü sunuyoruz.
Abstract
Parsiyel hepatektomi, farelerde karaciğer rejenerasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak aşağı akış tek hücreli uygulamalar için yüksek verimli hepatositlerin izolasyonu zordur. Farelerde normal karaciğer rejenerasyonunun ilk 2 günü boyunca rejenere hepatositler içinde belirgin bir lipit birikimi gözlenir. Geçici rejenerasyonla ilişkili steatoz (TRAS) olarak adlandırılan bu durum geçicidir ancak majör proliferatif faz ile kısmen örtüşür. Yoğunluk-gradyan saflaştırma, primer hepatositlerin izolasyonu için mevcut protokollerin çoğunun bel kemiğidir. Gradyan saflaştırma, hücrelerin yoğunluğuna ve boyutuna dayandığından, steatotik olmayanları steatotik hepatosit popülasyonlarından ayırır. Bu nedenle, yağlı hepatositler sıklıkla kaybolur ve temsili olmayan hepatosit fraksiyonları ortaya çıkar.
Sunulan protokol, lipid içeriğinden bağımsız olarak rejenere hepatositlerin in vivo izolasyonu için kolay ve güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Erkek C57BL/6 farelerden alınan hepatositler, hepatektomiden 24-48 saat sonra klasik iki aşamalı kollajenaz perfüzyon yaklaşımı ile izole edilir. Standart bir peristaltik pompa, portal venden çıkışlı retrograd bir perfüzyon tekniği kullanarak, kateterize inferior vena kava yoluyla ısıtılmış çözeltileri kalıntıya yönlendirir. Hepatositler, Glisson kapsülünden salınmaları için kollajenaz ile ayrışır. Yıkama ve dikkatli santrifüjlemeden sonra, hepatositler herhangi bir aşağı akış analizi için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu yazıda farelerde parsiyel hepatektomi sonrası temsili bir rejenere hepatosit popülasyonunun izolasyonu için basit ve tekrarlanabilir bir teknik anlatılmaktadır. Yöntem ayrıca yağlı karaciğer hastalığının çalışmasına da yardımcı olabilir.
Introduction
Karaciğer, büyük doku kaybından sonra bile kendini yenileyebilir. Bu eşsiz rejeneratif kapasite, ilk olarak 1931’de Higgins ve Anderson tarafından sıçanlarda tanımlanan kısmi (% 70) hepatektominin deneysel modeli ile açıkça gösterilmiştir1. Bu modelde, karaciğerin% 70’i daha büyük karaciğer loblarını keserek hayvanlardan cerrahi olarak çıkarılır. Kalan loblar daha sonra orijinal karaciğer mimarisinin restorasyonu olmadan da olsa, ameliyattan yaklaşık 1 hafta sonra orijinal karaciğer kütlesini geri yüklemek için telafi edici hipertrofi yoluyla büyür 2,3. Karaciğer kalıntısının iyileşmek için çok küçük olduğu% 86 genişletilmiş hepatektomi gibi, değişen miktarlarda doku çıkarılmasına sahip ek hepatektomiler geliştirilmiştir, sonuçta posthepatektomi karaciğer yetmezliğine (PHLF) ve ardından hayvanların% 30-50’sinde ölüme yol açmıştır 4,5,6. Bu modeller, rezeke edilen doku miktarına bağlı olarak normal ve başarısız karaciğer rejenerasyonunun incelenmesini sağlar (Şekil 1).
Hepatektomilerin fare modelleri uzun yıllardır başarıyla kullanılmasına rağmen, son zamanlarda tek hücre düzeyinde daha derin bir içgörü sağlayan daha gelişmiş analitik yöntemlere sahiptir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu için, bireysel hepatositlerin varlığı temel bir önkoşuldur. Primer hepatositlerin izolasyonu için çoğu protokol, iki aşamalı bir kollajenaz perfüzyon tekniğine ve ardından canlı hepatositleri enkaz ve parankimal olmayan hücrelerden ayırmak için yoğunluk gradyanı saflaştırılmasına ve ayrıca ölü hücreleredayanmaktadır 7,8,9. Bu yöntem ilk olarak 1969 yılında Berry and Friend tarafından tanımlanmış10 ve Seglen ve meslektaşları tarafından 1972 yılında uyarlanmıştır11,12. Bununla birlikte, gradyan santrifüjleme hücrelerin yoğunluğuna ve boyutuna dayandığından, lipit yüklü hepatositler genellikle standart saflaştırma sırasında kaybolur. Bu tür bir kayıp birçok araştırma sorusu için ihmal edilebilir olsa da, erken karaciğer yenilenmesi için çok önemli bir husustur. İlk 2 gün boyunca, yenilenen fare karaciğeri içindeki hepatositler lipitleri biriktirir, böylece boyut olarak büyür ve yoğunluğa dalar. Bu geçici rejenerasyonla ilişkili steatoz (TRAS) rejeneratif yakıt sağlamaya hizmet eder ve geçicidir, ancak kısmen majör proliferatif faz ile örtüşür ve karaciğer lobülleri içinde eşit olmayan bir şekilde dağılır – karaciğerin fonksiyonel birimleri13,14. Bununla birlikte,% 86’lık uzatılmış hepatektomiden sonra, TRAS da ortaya çıkar, ancak devam eder, çünkü rejenerasyon durur ve lipitler oksitlenmez14. Bu nedenle,% 70 veya% 86 hepatektomiyi takiben hepatositlerin gradyan saflaştırılması, çoğu lipit yüklü hepatositin düşük yoğunluklu15 nedeniyle kaybolması nedeniyle temsili olmayan fraksiyonlar verecektir.
Bu modifiye izolasyon protokolünde, C57BL/6 farelerden alınan hepatositler, klasik iki aşamalı kollajenaz perfüzyon yaklaşımı ile hepatektomiden 24-48 saat sonra izole edilir. Genellikle, hücre izolasyonu için kalıntının kanülasyonu ve perfüzyonu portal ven yoluyla yapılır. Ancak majör rezeksiyon sonrası kalan küçük rezentlerde portovasküler direnç16 yüksekliğindedir ve bu nedenle perfüzyon hassastır. Vena kava hepatektomilerden etkilenmediği için, perfüzyon vena kavanın kanülasyonu yoluyla retrograd yönde kolayca yapılabilir. Standart bir peristaltik pompa, portal venden çıkışla retrograd perfüzyon kullanarak, kateterize inferior vena kava yoluyla ısıtılmış çözeltileri karaciğer kalıntısına yönlendirir (Ek Şekil S1). Hepatositler kollajenazlar tarafından ayrışır ve Glisson kapsülünden salınır. Düşük hızlı bir santrifüjleme yaklaşımı kullanılarak kademeli izolasyon ile canlı hepatositlerin yıkanması ve dikkatli bir şekilde işlenmesinden sonra, hepatositler herhangi bir aşağı akış analizi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yayınlanan protokol, tek hücreli aşağı akış analizleri veya FACS sıralamayı takiben hücrelerin toplu analizi için yüksek miktarda normal ve steatotik murin hepatositlerini izole etmek için güvenilir ve basit bir yöntem sağlar. Yoğunluk gradyanı saflaştırmaya göre belirgin avantaj, hücresel lipit içeriğinin hepatositlerin etkili verimi üzerinde esasen hiçbir etkisi olmamasıdır. Böylece, steatotik hepatositlerin fraksiyonu korunacak ve aşağı akış analizlerine dahil edilecektir. Bu sadece s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İsviçre Ulusal Fonud (proje hibesi 310030_189262) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
