طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد
Summary
هنا نصف إثراء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد من خلال طريقة الطرد المركزي التفاضلي الأمثل.
Abstract
يمكن أن تعكس الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) المشتقة من الأنسجة الحالة الوظيفية للخلايا المصدر وخصائص الفضاء الخلالي للنسيج. يعد الإثراء الفعال لهذه المركبات الكهربائية شرطا أساسيا مهما لدراسة وظيفتها البيولوجية ومفتاحا لتطوير تقنيات الكشف السريري وتكنولوجيا الناقل العلاجي. من الصعب عزل sEVs عن الأنسجة لأنها عادة ما تكون ملوثة بشدة. توفر هذه الدراسة طريقة للإثراء السريع ل sEVs عالية الجودة من أنسجة سرطان الكبد. تتضمن الطريقة عملية من أربع خطوات: حضانة الإنزيمات الهاضمة (كولاجيناز D و DNase Ι) بالأنسجة ، والترشيح من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. نظرا لتحسين خطوة الطرد المركزي التفاضلي وإضافة خطوة ترشيح ، فإن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة أعلى من تلك التي حققها الطرد المركزي التفاضلي الكلاسيكي. يوفر منهجية مهمة وبيانات داعمة لدراسة sEVs المشتقة من الأنسجة.
Introduction
يبلغ قطر الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) حوالي 30 نانومتر إلى 150 نانومتر وتفرزها خلايا مختلفة1. يمكنهم التواصل مع خلايا الأنسجة وتنظيم البيئة المكروية المحلية أو البعيدة عن طريق نقل جزيئات بيولوجية مهمة مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة والخلايا والأجزاء داخل الخلايا. وبالتالي ، يمكنهم أيضا تغيير سلوك الخلايا المتلقية 2,3. يعد عزل وتنقية sEVs المحددة شرطا أساسيا لدراسة سلوكها البيولوجي أثناء تطور المرض ومساره. يستخدم الطرد المركزي التفاضلي – الذي يعتبر المعيار الذهبي – بشكل شائع لفصل sEVs عن الأنسجة التي يقيمون فيها عادة4. يمكن إزالة حطام الأنسجة وحطام الخلايا والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج بواسطة هذه التقنية ، مع ترك sEVs فقط.
لقد ثبت أن كولاجيناز D و DNase I لا يؤثران على الخصائص الجزيئية للخلايا أو الحويصلات ، حيث تساهم خصائص كلا الإنزيمين في إطلاق الحويصلات في المصفوفة خارج الخلية 5. تم استخدام هذه الإنزيمات لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الجلد النقيلي البشري ، وأنسجة سرطان القولون ، والأنسجة المخاطية القولونية5،6،7. ومع ذلك ، فإن تركيز ووقت هضم كولاجيناز D و DNase I في هذه الطرق يختلفان ، مما يؤدي إلى استنتاجات غير متسقة. لتجنب الترسيب المشترك لأنواع فرعية أخرى من sEVs ، قام الباحثون بإزالة حويصلات أكبر خارج الخلية (قطرها 0.1 ميكرومتر أو 0.2 ميكرومتر) عن طريق الترشيح و / أو الطرد المركزي التفاضلي8. اعتمادا على الأنسجة المصدر ، قد تكون هناك حاجة إلى طرق مختلفة للعزل والتنقية 9,10.
يؤدي استخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي التقليدي لاستخراج sEVs من أنسجة الكبد إلى طبقة من المادة البيضاء على سطح المادة الطافية ، دون أي طريقة لتحديد خصائصها. في دراسة سابقة11 ، وجد أن هذه الطبقة من المادة البيضاء تؤثر على نقاء sEVs. على الرغم من أن عدد الجسيمات وتركيز البروتين للعينات المعزولة بالطريقة التقليدية كانا أعلى من تلك الموجودة في الطريقة الحالية ، إلا أن معامل الاختلاف كان كبيرا ، ربما لأن العديد من الملوثات يمكن أن تؤدي إلى ضعف تكرار النتائج. أي باستخدام المنظفات (أي اكتشاف قابلية ذوبان الجسيمات في 1٪ Triton X-100) ، وجدنا أن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة كان أكبر. ومن ثم ، فإننا نستخدم هذه الطريقة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم للبحث البروتيني.
في الوقت الحاضر ، تركز الأبحاث حول sEVs في سرطان الكبد بشكل أساسي على المصل والبلازما والمادة الطافية لثقافة الخلايا12،13،14. ومع ذلك ، يمكن أن تعكس sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بشكل أكثر دقة علم الأمراض الفسيولوجية والبيئة المكروية المحيطة بسرطان الكبد وتتجنب بشكل فعال تدهور وتلوث المركبات الكهربائية الأخرى15,16. مع استخدام الطرد المركزي التفاضلي ، يمكن لهذه الطريقة إثراء الغلة والحصول على sEVs عالية الجودة ، مما يوفر أساسا مهما لمزيد من الدراسة لسرطان الكبد. تتيح هذه الطريقة فصل أنسجة سرطان الكبد عن طريق الفصل الحاد وفصلها عن طريق كولاجيناز D و DNase I. بعد ذلك ، تتم إزالة الحطام الخلوي والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج عن طريق الترشيح والطرد المركزي التفاضلي. أخيرا ، يتم عزل sEVs وتنقيتها للدراسات اللاحقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الكبد. يتم الحصول على sEVs عالية الجودة عن طريق عزل الأنسجة الحادة ، والعلاج بالإنزيمات الهضمية ، والطرد المركزي التفاضلي ، وترشيح وتنقية غشاء المرشح 0.22 ميكرومتر. بالنسبة لتحليل المصب ، من المهم للغاية ضمان النقاء العالي للم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية على دعم هذا العمل. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
