Procédé d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie
Summary
Nous décrivons ici l’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie grâce à une méthode d’ultracentrifugation différentielle optimisée.
Abstract
Les petites vésicules extracellulaires (sEV) dérivées du tissu peuvent refléter l’état fonctionnel des cellules sources et les caractéristiques de l’espace interstitiel du tissu. L’enrichissement efficace de ces sEV est une condition préalable importante à l’étude de leur fonction biologique et une clé pour le développement de techniques de détection clinique et de technologie de support thérapeutique. Il est difficile d’isoler les sEV des tissus, car ils sont généralement fortement contaminés. Cette étude fournit une méthode pour l’enrichissement rapide de sEVs de haute qualité à partir de tissus cancéreux du foie. La méthode implique un processus en quatre étapes: l’incubation des enzymes digestives (collagénase D et DNase Ι) avec les tissus, la filtration à travers une passoire cellulaire de 70 μm, l’ultracentrifugation différentielle et la filtration à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Grâce à l’optimisation de l’étape d’ultracentrifugation différentielle et à l’ajout d’une étape de filtration, la pureté des sEV obtenus par cette méthode est supérieure à celle obtenue par l’ultracentrifugation différentielle classique. Il fournit une méthodologie importante et des données à l’appui pour l’étude des EV dérivés de tissus.
Introduction
Les petites vésicules extracellulaires (sEV) mesurent environ 30 nm à 150 nm de diamètre et sont sécrétées par diverses cellules1. Ils peuvent communiquer avec les cellules tissulaires et réguler le microenvironnement local ou distant en transportant des molécules biologiques importantes telles que les lipides, les protéines, l’ADN et l’ARN vers divers organes, tissus, cellules et parties intracellulaires. Ainsi, ils peuvent également modifier le comportement des cellules receveuses 2,3. L’isolement et la purification de sEVs spécifiques est une condition préalable essentielle à l’étude de leur comportement biologique au cours du développement et de l’évolution de la maladie. L’ultracentrifugation différentielle, considérée comme l’étalon-or, est couramment utilisée pour séparer les sEV des tissus dans lesquels ils résident normalement4. Les débris tissulaires, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques peuvent être éliminés par cette technique, ne laissant que les sEV.
Il a été démontré que la collagénase D et la DNase I n’affectent pas les caractéristiques moléculaires des cellules ou des vésicules, les propriétés des deux enzymes contribuant à la libération de vésicules dans la matrice extracellulaire 5. Ces enzymes ont été utilisées pour extraire les sEV du tissu de mélanome métastatique humain, du tissu cancéreux du côlon et du tissu de la muqueuse colique 5,6,7. Cependant, la concentration et le temps de digestion de la collagénase D et de la DNase I dans ces méthodes diffèrent, ce qui conduit à des conclusions incohérentes. Pour éviter la coprécipitation d’autres sous-types de SEV, les chercheurs ont retiré des vésicules extracellulaires plus grandes (0,1 μm ou 0,2 μm de diamètre) par filtration et/ou centrifugation différentielle8. Selon le tissu source, différentes méthodes d’isolement et de purification peuvent être nécessaires 9,10.
L’utilisation de la méthode traditionnelle d’ultracentrifugation différentielle pour extraire les sEV du tissu hépatique entraîne une couche de substance blanche à la surface du surnageant, sans aucun moyen de déterminer ses propriétés. Dans une étude précédente11, cette couche de substance blanche affectait la pureté des sEV. Bien que le nombre de particules et la concentration en protéines des échantillons isolés par la méthode traditionnelle soient plus élevés que ceux de la méthode actuelle, le coefficient de variation était important, peut-être parce que de nombreux polluants peuvent entraîner une mauvaise répétabilité des résultats. C’est-à-dire qu’en utilisant un détergent (c’est-à-dire en détectant la solubilité des particules dans 1% Triton X-100), nous avons constaté que la pureté des sEV obtenus par cette méthode était plus grande. Par conséquent, nous utilisons cette méthode pour isoler et purifier les sEV dérivés du tissu du cancer colorectal pour la recherche protéomique.
À l’heure actuelle, la recherche sur les sEV dans le cancer du foie se concentre principalement sur le sérum, le plasma et le surnageant de la culture cellulaire12,13,14. Cependant, les sEV dérivés du tissu cancéreux du foie peuvent refléter plus précisément la pathologie physiologique et le microenvironnement environnant du cancer du foie et éviter efficacement la dégradation et la pollution d’autres VE15,16. Avec l’utilisation de l’ultracentrifugation différentielle, cette méthode peut enrichir le rendement et obtenir des EVE de haute qualité, fournissant une base importante pour l’étude ultérieure du cancer du foie. Cette méthode permet de séparer le tissu cancéreux du foie par séparation nette et d’être dissocié par la collagénase D et la DNase I. Ensuite, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques sont éliminés par filtration et ultracentrifugation différentielle. Enfin, les sEV sont isolés et purifiés pour des études ultérieures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode reproductible pour extraire les sEV du tissu cancéreux du foie. Les sEVs de haute qualité sont obtenus par isolation nette des tissus, traitement avec des enzymes digestives, ultracentrifugation différentielle et filtration et purification de la membrane filtrante de 0,22 μm. Pour l’analyse en aval, il est extrêmement important de garantir la haute pureté des sEV. Dans le processus de centrifugation différentielle, une couche de substances blanches (composition inconnue) appara?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan pour son soutien à ce travail. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
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