यकृत कैंसर ऊतक से प्राप्त छोटे बाह्य पुटिकाओं के लिए एक संवर्धन विधि
Summary
यहां हम एक अनुकूलित अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि के माध्यम से यकृत कैंसर ऊतक से प्राप्त छोटे बाह्य पुटिकाओं के संवर्धन का वर्णन करते हैं।
Abstract
ऊतक से प्राप्त छोटे बाह्य पुटिका (एसईवी) स्रोत कोशिकाओं की कार्यात्मक स्थिति और ऊतक के अंतरालीय स्थान की विशेषताओं को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इन एसईवी का कुशल संवर्धन उनके जैविक कार्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है और नैदानिक पहचान तकनीकों और चिकित्सीय वाहक प्रौद्योगिकी के विकास की कुंजी है। ऊतक से एसईवी को अलग करना मुश्किल है क्योंकि वे आमतौर पर भारी दूषित होते हैं। यह अध्ययन यकृत कैंसर ऊतक से उच्च गुणवत्ता वाले एसईवी के तेजी से संवर्धन के लिए एक विधि प्रदान करता है। विधि में एक चार-चरण यी प्रक्रिया शामिल है: ऊतक के साथ पाचन एंजाइमों (कोलेजनेज डी और डीनेस ए) का इनक्यूबेशन, 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से निस्पंदन, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, और 0.22 μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन। विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण के अनुकूलन और निस्पंदन चरण के अतिरिक्त के कारण, इस विधि द्वारा प्राप्त एसईवी की शुद्धता क्लासिक डिफरेंशियल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त की गई तुलना में अधिक है। यह ऊतक-व्युत्पन्न एसईवी के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति और सहायक डेटा प्रदान करता है।
Introduction
छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) व्यास में लगभग 30 एनएम से 150 एनएम होते हैं औरविभिन्न कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं। वे ऊतक कोशिकाओं के साथ संवाद कर सकते हैं और लिपिड, प्रोटीन, डीएनए और आरएनए जैसे महत्वपूर्ण जैविक अणुओं को विभिन्न अंगों, ऊतकों, कोशिकाओं और इंट्रासेल्युलर भागों में परिवहन करके स्थानीय या दूर के माइक्रोएन्वायरमेंट को विनियमित कर सकते हैं। इस प्रकार, वे प्राप्तकर्ता कोशिकाओं2,3 के व्यवहार को भी बदल सकते हैं। विशिष्ट एसईवी का अलगाव और शुद्धिकरण रोग के विकास और पाठ्यक्रम के दौरान उनके जैविक व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक शर्त है। विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-जिसे सोने के मानक के रूप में माना जाता है- आमतौर पर एसईवी को उन ऊतकों से अलग करने के लिए उपयोग कियाजाता है जिनमें वे सामान्य रूप से रहते हैं। ऊतक मलबे, सेल मलबे, बड़े पुटिकाओं और एपोप्टोटिक निकायों को इस तकनीक द्वारा हटाया जा सकता है, केवल एसईवी को छोड़कर।
कोलेजनेज डी और डीनेस आई को कोशिकाओं या पुटिकाओं की आणविक विशेषताओं को प्रभावित नहीं करने के लिए दिखाया गया है, दोनों एंजाइमों के गुण बाह्य मैट्रिक्स 5 में पुटिकाओं की रिहाई में योगदान करते हैं। इन एंजाइमों का उपयोग मानव मेटास्टैटिक मेलेनोमा ऊतक, बृहदान्त्र कैंसर ऊतक और कोलोनिक म्यूकोसल ऊतक 5,6,7 से एसईवी निकालने के लिए किया गया है। हालांकि, इन विधियों में कोलेजनेज डी और डीनेस आई की एकाग्रता और पाचन समय भिन्न होता है, जिससे असंगत निष्कर्ष निकलते हैं। एसईवी के अन्य उपप्रकारों के सह-फैलाव से बचने के लिए, शोधकर्ताओं ने निस्पंदन और / या अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन8 द्वारा बड़े बाह्य पुटिकाओं (0.1 μm या व्यास में 0.2 μm) को हटा दिया है। स्रोत ऊतक के आधार पर, अलगाव और शुद्धिकरण के विभिन्न तरीकों की आवश्यकता हो सकती है 9,10।
यकृत ऊतक से एसईवी निकालने के लिए पारंपरिक अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करने से सुपरनैटेंट की सतह पर सफेद पदार्थ की एक परत होती है, इसके गुणों को निर्धारित करने का कोई तरीका नहीं होता है। पिछले अध्ययन11 में, सफेद पदार्थ की यह परत एसईवी की शुद्धता को प्रभावित करने के लिए पाई गई थी। यद्यपि पारंपरिक विधि द्वारा पृथक नमूनों की कण संख्या और प्रोटीन एकाग्रता वर्तमान विधि की तुलना में अधिक थी, भिन्नता का गुणांक बड़ा था, संभवतः क्योंकि कई प्रदूषक परिणामों की खराब पुनरावृत्ति का कारण बन सकते हैं। यही है, डिटर्जेंट का उपयोग करके (यानी, 1% ट्राइटन एक्स -100 में कणों की घुलनशीलता का पता लगाना), हमने पाया कि इस विधि द्वारा प्राप्त एसईवी की शुद्धता अधिक थी। इसलिए, हम प्रोटिओमिक अनुसंधान के लिए कोलोरेक्टल कैंसर ऊतक से प्राप्त एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए इस विधि का उपयोग करते हैं।
वर्तमान में, यकृत कैंसर में एसईवी पर शोध मुख्य रूप से सीरम, प्लाज्मा और सेल कल्चर के सुपरनैटेंट 12,13,14 पर केंद्रित है। हालांकि, यकृत कैंसर ऊतक से प्राप्त एसईवी शारीरिक विकृति और यकृत कैंसर के आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित कर सकते हैं और प्रभावी ढंग से अन्य ईवी15,16 के क्षरण और प्रदूषण से बच सकते हैं। विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के उपयोग के साथ, यह विधि उपज को समृद्ध कर सकती है और उच्च गुणवत्ता वाले एसईवी प्राप्त कर सकती है, जो यकृत कैंसर के आगे के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण आधार प्रदान करती है। यह विधि यकृत कैंसर ऊतक को तेज पृथक्करण द्वारा अलग करने और कोलेजनेज डी और डीनेस आई द्वारा अलग करने में सक्षम बनाती है। फिर, सेलुलर मलबे, बड़े पुटिकाओं और एपोप्टोटिक निकायों को निस्पंदन और अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया जाता है। अंत में, एसईवी को बाद के अध्ययनों के लिए अलग और शुद्ध किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल यकृत कैंसर ऊतक से एसईवी निकालने के लिए एक दोहराने योग्य विधि का वर्णन करता है। उच्च गुणवत्ता वाले एसईवी तेज ऊतक अलगाव, पाचन एंजाइमों के साथ उपचार, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और 0.22 μm फ़िल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस काम का समर्थन करने के लिए गन्नान मेडिकल यूनिवर्सिटी के पहले संबद्ध अस्पताल को धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82260422) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
References
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
