Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لتوصيل الأدوية والعوامل المعدلة للتعبير الجيني حول الأوعية الدموية في الجنين النامي في الرحم . الأهم من ذلك ، يمكن قياس تأثير الأدوية / العوامل على تدفق الدم مع تطور الحمل.
Abstract
تعرف قدرة الكائن الحي على الحفاظ على تدفق دم مستمر إلى الدماغ استجابة للارتفاعات المفاجئة في ضغط الدم النظامي (BP) باسم التنظيم الذاتي الدماغي (CAR) ، والذي يحدث في الشريان السباتي. على عكس حديثي الولادة الناضجين، فإن حديثي الولادة الخدج غير قادرين على تقليل تدفق الدم الدماغي (CBF) استجابة لزيادة ضغط الدم الجهازي. في حديثي الولادة الخدج ، يعرض هذا الأوعية الدماغية الهشة لضغوط نضح عالية ، مما يؤدي إلى تمزقها وتلف الدماغ. أظهرت الدراسات خارج الجسم الحي باستخدام التصوير العضلي السلكي أن الشرايين السباتية من الأجنة على المدى القريب تنقبض استجابة لتنشيط مستقبلات ألفا 1 الأدرينالية. هذه الاستجابة ضعيفة في الجنين الخدج. وبالتالي ، لدراسة دور alpha1-AR في الجسم الحي ، يتم تقديم هنا نهج مبتكر لتحديد آثار الأدوية على الجزء الشرياني السباتي في الجسم الحي في جنين أغنام أثناء التقدم التنموي للحمل. توضح البيانات المقدمة القياس المتزامن لتدفق دم الجنين وضغط الدم. يمكن استخدام نظام الولادة حول الأوعية لإجراء دراسة طويلة الأجل على مدار عدة أيام. يمكن أن تشمل التطبيقات الإضافية لهذه الطريقة أنظمة توصيل فيروسية لتغيير التعبير عن الجينات في جزء من الشريان السباتي. يمكن تطبيق هذه الطرق على الأوعية الدموية الأخرى في الكائن الحي المتنامي في الرحم وكذلك في الكائنات البالغة.
Introduction
الولادة تسبب الإجهاد للجنين ، وهناك زيادة كبيرة في مستويات الكاتيكولامين ، هرمون التوتر الرئيسي 1,2. هذا يرفع ضغط الدم الجهازي ، وإذا انتقل هذا الضغط إلى الشعيرات الدموية الهشة في الدماغ عبر الشرايين السباتية ، فقد يؤدي ذلك إلى تمزقها3،4،5. يتم منع الطفرات في ضغط الدم الجهازية من الوصول إلى الدماغ عن طريق انقباض الشرايين السباتية في الجنين كامل المدة. ومع ذلك ، لم يتم تطوير هذه الآلية في الجنين الخدج ، وهذا هو المسؤول عن احتمال أعلى بكثير لتلف الدماغ في الأجنة الخدج 4,5.
حاليا ، لا توجد طريقة مناسبة لفحص نضوج المسارات المشاركة في تنظيم تدفق الدم السباتي مع الأجنة النامية. هذه الدراسات حول تدفق الدم السباتي والاستجابة للأوعية حاسمة من كل من العلوم الأساسية والمنظورات السريرية. حاليا ، لتحديد المسارات الجزيئية المشاركة في تنظيم انقباض الشرايين ، تتضمن الطريقة القياسية عزل الأجزاء الشريانية بعد الوفاة. بعد ذلك ، يتم إجراء التجارب باستخدام التصوير العضلي السلكي لتحديد انقباض الأوعية للجزيئات الدوائية المختلفة التي تحدد المسارات التنظيمية التي ينطوي عليها انقباض الشرايين 6,7. وتجدر الإشارة إلى أن النتائج خارج الجسم الحي غير قادرة على تكرار البيئة في الجسم الحي بشكل كامل بسبب تنظيم تدفق الدم في المنبع والمصب للشريان السباتي. وبالتالي ، تهدف الدراسة الحالية إلى تطوير تقنية يمكنها تحديد آثار المواد الكيميائية أو العوامل المستجيبة للأوعية على تدفق الدم في الشريان في الجسم الحي.
توفر منهجية التوصيل حول الأوعية الموصوفة في هذه المقالة نهجا في الجسم الحي لدراسة تأثير التلاعب الدوائي أو الجيني لمسارات الإشارات على قطاعات الشرايين المختلفة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء التلاعب بضغط دم الجنين وتدفق الدم السباتي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض التجارب على أجنة الأغنام لدراسة آثار جزيئات الإشارة في الجنين النامي. نأمل أن تؤدي المنهجية التفصيلية المقدمة إلى تحقيقات جديدة في مجال دراسات تدفق الدم ، خاصة فيما يتعلق بفسيولوجيا الجنين وعلم الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بالنسبة للدراسة الحالية ، تم الحصول على الموافقة على التجارب على من لجنة رعاية واستخدام بجامعة أريزونا. تم استخدام نعاج كولومبيا-رامبوييه الحامل التي تزاوج مرة واحدة بين 2-4 سنوات من العمر في الدراسة الحالية. تم الحصول على من وحدة الأغنام بجامعة أريزونا.
1. صيانة
- الحصول على من أي مزرعة الأغنام.
- نقل النعاج إلى المختبر في 105 أيام ± 5 أيام إلى 137 يوما ± 5 أيام من عمر الحمل (dGA). الحفاظ على الأغنام عند درجة حرارة 22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية في الرطوبة المحيطة. توفير كريات البرسيم (انظر جدول المواد), أملاح, والمياه ad libitum.
2. إعداد المواد
- بناء نظام القسطرة حول الأوعية الدموية.
- قم بربط أحد طرفي أنابيب Tygon بطول 4 أقدام إلى أنبوب مضخة مشعب 2 سم (MPT) (انظر جدول المواد). قم بتوصيل الطرف الآخر من MPT مقاس 2 سم ب 4 أقدام أخرى من أنبوب Tygon.
- قم بعمل شق صغير في MPT بحيث يمكن للسائل / العوامل الخروج إلى الفضاء حول الأوعية.
- تعقيم مجسات التدفق (انظر جدول المواد) والقسطرة ومفك البراغي الصغير باستخدام طريقة تعقيم الغاز.
3. إعداد قبل الجراحة
- الحصول على الموافقة على التجارب على من لجنة رعاية واستخدام المؤسسية.
- قبل الجراحة ، احتفظ بالنعاج على طعام لا شيء في نظام التشغيل (NPO) لمدة 24 ساعة ومياه NPO لمدة 16 ساعة. في يوم الجراحة ، لف وجه النعجة بوسادة لحماية عينيها. حلق الجانب الأيسر من الرقبة لفضح الوريد الوداجي ، وتنظيف الجلد باستخدام البوفيدون اليود و 70 ٪ من الإيثانول.
- ضع قسطرة وريدية (IV) في الوريد الوداجي للنعجة ، وقم بتثبيتها على الجلد بشريط مقاوم للماء ومشابك جرح (انظر جدول المواد).
- تخدير النعاج بإعطاء الديازيبام الوريدي (0.15 ملغ/كغ) وهيدروكلوريد الكيتامين (16 ملغ/كغ). تطبيق الحقن العضلي لمعلق البروكايين G من البنسلين G (25000 I/kg) والكيتوبروفين الوريدي (2.2 ملغ/كغ) (انظر جدول المواد).
- احلق موقع شق الأغنام والمناطق المحيطة بها (البطن والأجنحة والفخذ) باستخدام كليبرز شفرة # 10. لضمان إزالة الصوف بالكامل ، أعد حلاقة المنطقة بشفرة # 40. اغسل المنطقة المحلوقة بمنظف مبيد للجراثيم (انظر جدول المواد) والماء. تجف مع وسادة يمكن التخلص منها.
- تأكد من عمق التخدير (يتم تحديده والحفاظ عليه من خلال الاستجابة لقرص الجلد ، ومنعكس القرنية ، وتقييم لون الفك) ، ثم تنبيب النعجة بأنبوب القصبة الهوائية بقطر داخلي 6.5-7.5 مم (انظر جدول المواد) ، وثبت الأنبوب في مكانه. ضع النعجة على طاولة الرفع في وضع الاستلقاء الجانبي ، وانقلها إلى طاولة جراحية على شكل حرف V في وضع الاستلقاء.
- ثبت أطراف النعجة على الطاولة الجراحية على شكل حرف V باستخدام ربطات جراحية. أحضر النعجة إلى وضع Trendelenburg لتخفيف الضغط على وحدة الجنين والمشيمة.
- قم بتوصيل مسبار مقياس التأكسج النبضي (انظر جدول المواد) بلسان / أذن النعجة لمراقبة تشبع أوكسي هيموغلوبين ومعدل ضربات القلب باستمرار. ضع مقياس حرارة تحت لسان النعجة لمراقبة درجة الحرارة.
- قم بتوصيل الأنبوب الرغامي بالدائرة التنفسية لآلة التخدير ، وابدأ التهوية الميكانيكية أثناء مراقبة ثاني أكسيد الكربون2 منتهي الصلاحية.
- الحفاظ على التخدير عن طريق ضبط الأيزوفلوران بين 2.5٪ -4٪ طوال الجراحة. تأكد من تخدير بشكل كاف عن طريق قرص الأذن. تطبيق محلول بولي أيوني متوازن (محلول ملحي 0.9٪ وزن/حجم) عند 5 مل/كغ/ساعة باستخدام القسطرة الوداجية الموضوعة خلال الخطوة 3.2.1.
- أداء فرك معقمة. رش منطقة البطن والأجنحة بمحلول البوفيدون (محلول اليود 10٪). افرك المنطقة بشاش مبلل باليود بدءا من موقع الشق والعمل للخارج ، مع التأكد من عدم العودة إلى المركز بعد الفرك للخارج.
- بعد ذلك ، قم برش المنطقة بالإيثانول (70٪ إيثانول بدون وزن) ، وافركها بشاش مبلل بالإيثانول بطريقة مشابهة للتنظيف باستخدام البوفيدون. كرر العملية برمتها ثلاث مرات. رش المنطقة بمحلول البوفيدون.
- يسخن المحلول الملحي في وعاء معقم ، ويصل إلى 37 درجة مئوية. احتفظ بهذا بالقرب من طاولة الجراحة. قم بتوصيل الكي (انظر جدول المواد).
- اطلب من أعضاء الفريق الجراحي ارتداء القبعات وأقنعة الوجه وأغطية الأحذية وغسل أيديهم (فرك جراحي) وارتداء العباءات والقفازات الجراحية المعقمة. من هذه النقطة فصاعدا ، يجب اتباع ممارسة جراحية معقمة صارمة.
- قم بثني منطقة بطن الأغنام المعقمة بمناشف معقمة.
4. الإجراء الجراحي
- إضفاء الطابع الخارجي على الجنين
- بعد التأكد من عمق التخدير الكافي ، قم بإجراء شق البطن القياسي 10 سم باستخدام مشرط (شفرة # 20) فوق خط ألبا من السرة إلى الجزء القحفي من الضرع. السيطرة على النزيف أثناء إجراء شق مع الكي (إعدادات الطاقة: 50 قطع و 25 تخثر).
- قم بعمل شق صغير عبر خط الوسط لجدار الجسم أسفل شق الجلد ، وافتح تجويف البطن باستخدام مقص Metzenbaum (انظر جدول المواد).
- قم بإخراج الرحم الذي يحتوي على الجنين من خلال جدار البطن مع وضع مناشف جراحية معقمة تحته (بين بطن الأم والرحم). جس الرحم لتحديد وضع الجنين والنبتات. باستخدام الكي ، قم بعمل شق ~ 10 سم عبر جدار الرحم مع انحناء كبير فوق ظهر الرأس ، وتجنب أي أوعية دموية ومشيمة مرئية.
- استخدم أربعة مشابك بابكوك (انظر جدول المواد) لتأمين الرحم وأغشية المشيمة ، واسحب مشابك بابكوك في الزوايا الأربع المتعارضة لجعل رأس الجنين مرئيا. قم بإخراج النصف الجحفي من الجنين من خلال هذا الشق ، وقم بتغطية رأس الجنين بقفاز معقم غير مطاطي مملوء بمحلول ملحي دافئ ومعقم (37 درجة مئوية) لمنع بدء التنفس.
- بعد التأكد من عمق التخدير الكافي ، قم بإجراء شق البطن القياسي 10 سم باستخدام مشرط (شفرة # 20) فوق خط ألبا من السرة إلى الجزء القحفي من الضرع. السيطرة على النزيف أثناء إجراء شق مع الكي (إعدادات الطاقة: 50 قطع و 25 تخثر).
- أجهزة قسطرة الشريان السباتي حول الأوعية الدموية
- عند إزالة رأس الجنين من الرحم ، اطلب من أحد المساعدين إمساك ملقط بابكوك برفق في وضع مستقيم لتقليل فقد السائل الأمنيوسي. مع تعرض عنق الجنين ، قم بإجراء شق جلدي مائل 3-3.5 سم على طول الحدود الأمامية للعضلة القصية الترقوية الخشائية (SCM) على جانب واحد من الرقبة في المنطقة الوسطى ، وافصل اللفافة بملقط البعوض.
- قسم platysma ، وقم بإجراء تشريح على طول الحدود الإنسية لعضلة SCM من وترها بشكل متفوق إلى مستوى العضلة اللامية السفلية. سيؤدي سحب SCM إلى كشف الصفيحة السباتية ، التي تحتوي بشكل سطحي على وريد وداجي داخلي رقيق الجدران ، وتحته سيكون الشريان السباتي كوعاء سميك الجدران.
- سحب الجلد مع المشابك بابكوك ، وإجراء تشريح حاد لتحرير الشريان السباتي من الأنسجة المحيطة وورقة السباتي.
- خذ مسبار التدفق مقاس 3 مم (انظر جدول المواد) من العبوة المعقمة ، وقم بفك لوحة دعم المسبار ، وحركه لفتحه لكشف الحامل L. ارفع الشريان السباتي بعناية ، واربط الدعامة برفق أسفل الوعاء مع تجنب ملامسة الوعاء.
- استخدم الملقط لإغلاق كتيفة مسبار التدفق عن طريق تحريك لوحة الدعم برفق إلى وضع مغلق. قم بتأمين كتيفة مسبار التدفق عن طريق شد المسمار الخلفي لمسبار التدفق. لتسهيل هذه العملية ، أمسك أطراف مسبار التدفق برفق بالملقط لتثبيت مسبار التدفق أثناء شد المسمار.
- قبل شطف القسطرة المحيطة بالأوعية الدموية ، ووضعها في المنطقة المجاورة للشريان السباتي القريب من مسبار التدفق. تأكد من أن الشق المفتوح للقسطرة المحيطة بالأوعية الدموية قريب من الشريان السباتي.
- باستخدام خياطة حريرية غير قابلة للامتصاص 3-0 ، قم بتأمين الأطراف القريبة والبعيدة للجهاز حول الأوعية الدموية ومسبار التدفق إلى النسيج الخلالي القريب. أغلق موقع الشق باستخدام غرزة مستمرة ، وأغلق جلد الجنين بخياطة حرير 3-0 غير قابلة للامتصاص ، وقم بتثبيت القسطرة على الجلد عن طريق لف الخيط حول القسطرة ثلاث مرات. انزع القفاز ، وضع رأس الجنين مرة أخرى في الرحم.
- عند إزالة رأس الجنين من الرحم ، اطلب من أحد المساعدين إمساك ملقط بابكوك برفق في وضع مستقيم لتقليل فقد السائل الأمنيوسي. مع تعرض عنق الجنين ، قم بإجراء شق جلدي مائل 3-3.5 سم على طول الحدود الأمامية للعضلة القصية الترقوية الخشائية (SCM) على جانب واحد من الرقبة في المنطقة الوسطى ، وافصل اللفافة بملقط البعوض.
- قسطرة أطراف الجنين
- إضفاء الطابع الخارجي على الساق الخلفية للجنين. امسك الساق ، وقم بتدويرها جانبا لتصور منطقة الفخذ الداخلية. تنظيف المنطقة مع الشاش المعقم ، وإجراء شق 2 سم ، وفضح الشريان الفخذي. ضع مسبار التدفق وثبته باتباع إجراء مماثل كما هو الحال مع الشريان السباتي ، ثم أغلق الشق.
- قم بعمل شق 2 سم على طول الجانب الإنسي من الساق ~ 0.5 سم البعيد إلى الركبة. كشف الشريان الظنبوبي الخلفي (سميك الجدران) والوريد الصافن (رقيق الجدران). أدخل قسطرة البولي فينيل (القطر الخارجي: 1.4 مم والقطر الداخلي: 0.9 مم) في الشريان الظنبوبي الخلفي والوريد الصافن باستخدام تقنية القطع القياسية ، كما هو مذكور أدناه:
- حرر سفينة الاهتمام بتشريح حاد. اربط الجزء البعيد من الوعاء بخياطة حريرية 3-0 (بدون إبرة) باستخدام عقدة مربعة بثلاث رميات. ضع ربطة عنق ثانية خالية من الحرير مسبقا في الجانب القريب من الوعاء (أسفل الوعاء) ، لكن اترك الرباط غير مربوط. باستخدام مقص Castroviejo (انظر جدول المواد) ، قم بعمل قطع عرضي صغير في الوعاء 2 مم بالقرب من الرباط البعيد. يجب أن يكون طول القطع ~ 25٪ من قطر الوعاء.
- قم بتقييد تدفق الدم في الوعاء الدموي عن طريق سحب الخيط القريب غير المربوط برفق. املأ القسطرة بمحلول ملحي معقم بالهيبارين. أدخل الطرف المشطوف للقسطرة ، وادفع الطرف 20 سم في وعاء الجنين.
- ثبت القسطرة في مكانها بالملقط بينما يقوم المساعد بربط الخيط الحريري القريب لتأمين الوعاء بالقسطرة ؛ اربط الوعاء بالكامل حول القسطرة المدخلة باستخدام عقدة مربعة 2 مم من موقع الإدخال بثلاث رميات. اربط الرباط البعيد القريب بالرباط القريب الذي يثبت الوعاء بالقسطرة.
- أغلق شق الجلد باستخدام خياطة حرير 3-0 غير قابلة للامتصاص باستخدام نمط خياطة مستمر. تأكد من ربط الغرز حول القسطرة لتجنب تقييد تدفق الدم إذا تم سحبها. ضع قسطرة متدفقة مسبقا في الرحم ، وقم بتثبيتها على الجنين عن طريق خياطة باستخدام خياطة حريرية 3-0 غير قابلة للامتصاص.
5. وضع الجنين مرة أخرى وإغلاق الجرح
- أعد الجنين إلى الرحم. خياطة أغشية الجنين باستخدام 3-0 خيوط حريرية غير قابلة للامتصاص بنمط قفل مستمر (كوشينغ). أغلق الطبقة العضلية الرحمية باستخدام خياطة حرير 3-0 غير قابلة للامتصاص.
- أدخل قضيبا جراحيا من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 18 بوصة تحت الجلد على طول جدار البطن حتى المنطقة الطفيلية. دع الطرف القريب من القضيب يخرج من الموقع الطفيلي عن طريق إجراء شق 1 سم.
- قم بتوصيل القسطرة بالطرف البعيد من القضيب الجراحي ، واطلب من مساعد تغذية القسطرة وكابل مسبار التدفق عبر موقع الخروج الطفيلي عن طريق دفع القضيب بالكامل من خلال الفتحة الطفيلية.
- قم بتأمين جميع القسطرة وكابلات مسبار التدفق في موقع الشق النظير. ضع بشريط مقاوم للماء ، وقم بخياطة القسطرة على جلد النعجة. قم بخياطة كيس شبكي بلاستيكي إلى الجزء الخارجي من النعجة فوق القسطرة والتحقيق لتخزين القسطرة.
- باستخدام مادة خياطة اصطناعية قابلة للامتصاص 1-0 حيدة ، قم بتأمين خط ألبا بنمط مستمر. تأمين طبقة الجلد مع الدبابيس الجراحية.
- أوقف التخدير العام ، وقم بنزع النعجة بمجرد عودة ردود الفعل الحنجرية إلى خط الأساس الطبيعي. لا تترك دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكامل. انقل النعجة إلى عربة التمثيل الغذائي بمجرد أن تستقر حالتها بعد التخدير العام. أعد إلى غرفة تجربة ما بعد الجراحة بعد الشفاء التام من التخدير.
- تطبيق المسكنات بعد الجراحة عن طريق الوريد (10 ملغ/كغ/يوم فينيل بوتازوني) لمدة 3 أيام. اغسل القسطرة الوعائية يوميا بمحلول ملحي هيبارين (100 وحدة / مل من الهيبارين في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪).
6. تجارب ما بعد الجراحة في الجسم الحي
- اغسل القسطرة كل يوم بمحلول ملحي هيبارين (75 وحدة / مل). انتظر لمدة 72 ساعة قبل إجراء أي قياسات. لقياس تدفق الدم ، قم بتوصيل مجسات التدفق التي تم إدخالها في الجنين باستخدام وحدة التدفق حول الأوعية الدموية ب PowerLab وجهاز كمبيوتر مرفق.
ملاحظة: يمكن إجراء التسجيلات على برنامج PowerLab (انظر جدول المواد) لقياس تدفق الدم السباتي والفخذي. خذ القياس الأساسي لمدة 30 دقيقة. - قم بتوصيل القسطرة الشريانية والأمنيوسية بمضخم الجسر المتصل بمحول تناظري إلى رقمي (انظر جدول المواد). تطبيق بلعة 1 مل من 10 ميكرومتر فينيليفرين للجنين عن طريق الوريد، وقياس تدفق الشريان السباتي والفخذ لمدة 15 دقيقة. ثم انتظر لمدة 30 دقيقة أو حتى يعود تدفق الدم إلى خط الأساس.
- يغرس 1 مل من 10 ميكرومتر فينيليفرين في القسطرة المحيطة بالأوعية الدموية ، ويقيس تدفق الدم لمدة 15 دقيقة. اغسل فينيليفرين عن طريق إعطاء 5 مل من المحلول الملحي الدافئ من خلال القسطرة المحيطة بالأوعية. ثم انتظر لمدة 30 دقيقة أو حتى يعود تدفق الدم إلى خط الأساس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لفحص التلاعب الموضعي في الجسم الحي لتدفق الدم ، تم إعطاء 1 مل من فينيليفرين (10 ميكرومتر) ، وهو ناهضα 1-AR ، في الفضاء حول الأوعية الدموية للشريان السباتي بواسطة قسطرة تسريب خارجية لتحديد التأثير على تدفق الدم السباتي المحلي والتأثير على ضغط الدم النظامي. يوضح الشكل 1 أ انخفاضا كبيرا في تدفق الدم السباتي دون أي تأثير على ضغط الدم الجهازي في أغنام الجنين على المدى القريب. يوضح الشكل 1 ب البيانات نفسها للجنين المبتسر. أدى إعطاء 1 مل من PHE عن طريق الطريق الوريدي إلى زيادة تدفق الدم النظامي دون التأثير على تدفق الدم السباتي في الأغنام الجنينية على المدى القريب (الشكل 1C). يوضح الشكل 1 د البيانات نفسها للجنين المبتسر. في المقابل ، لم يكن لإدارة PHE بواسطة قسطرة حول الأوعية الدموية أي تأثير في الأغنام الخدج. ومع ذلك ، تسبب الإدارة عن طريق الوريد في زيادة كبيرة في كل من تدفق الدم السباتي و BP الجهازية. توضح هذه التجربة تكميم حول الأوعية يعمل بكامل طاقته يمكنه تنظيم تدفق الدم في الشريان السباتي في الرحم دون التأثير على ضغط الدم الجهازي. تظهر النتائج أن الأجنة الخدج لا تستجيب لتنظيم تدفق الدم السباتي بوساطة فينيليفرين. ومع ذلك ، فإن الاستجابة ناضجة في الأجنة على المدى القريب (الشكل 1E). الأهم من ذلك ، أن الإدارة الوريدية ل PHE زادت من تدفق الدم السباتي فقط في الأجنة المبكرة ، مع عدم وجود تأثير كبير في الأجنة على المدى القريب (الشكل 1G). ومع ذلك ، فإن الإدارة الوريدية ل PHE رفعت ضغط الدم النظامي في كل من الأجنة المبكرة والقريبة المدى (الشكل 1H). تظهر النتائج أيضا أن تقطير فينيليفرين حول الأوعية الدموية لم يكن له أي تأثير على ضغط الدم النظامي (الشكل 1F).
الشكل 1: التلاعب في تدفق الدم في الجسم الحي . أثر مثالي لقياسات خط الأساس لضغط الدم النظامي والشريان السباتي والتغيرات بعد إعطاء فينيليفرين (PHE) من خلال قسطرة حول الأوعية الدموية من (أ) جنين في الرحم على المدى القريب و (ب) جنين في الرحم قبل الأوان. أثر مثالي لقياسات خط الأساس لضغط الدم النظامي والشريان السباتي والتغيرات بعد إعطاء فينيليفرين (PHE) عن طريق الوريد من (C) وهو جنين في الرحم على المدى القريب و (د) جنين سابق لأوانه في الرحم . تظهر التغيرات في النسبة المئوية (E) لتدفق الدم السباتي و (F) ضغط الدم النظامي عبر نظام توصيل القسطرة حول الأوعية الدموية للأغنام قصيرة المدى والخدج. يتم عرض التغيرات في النسبة المئوية (G) لتدفق الدم السباتي وضغط الدم الجهازي (H) عن طريق الإدارة الجهازية للأغنام قصيرة المدى والخدج. توضح أشرطة الخطأ الخطأ القياسي للمتوسط. N = 4 في كل مجموعة. * P < 0.05 بواسطة اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حاليا ، لا توجد طريقة لفحص انقباض الأوعية وتضخمها في الجسم الحي استجابة لمركبات الأدوية والتلاعب بالجينات. كمعيار في هذا المجال ، يتم قياس تدفق الدم في الجسم الحي بواسطة مجسات تدفق دوبلر ، والكريات المجهرية ، والجزيئات المشعة مثل الماء المضاعف. ومع ذلك ، للتلاعب بوظائف المستقبلات أو إشارات المصب ، يتم التضحية بالحيوانات ، وتجرى التجارب في المختبر في حمامات الأعضاء بعد عزل الأجزاء الشريانية. توفر الطرق الحالية طريقة لإجراء التلاعب في الجسم الحي للأجزاء الشريانية عن طريق إدخال مواد كيميائية أو ناقلات لتعديل التعبير الجيني. علاوة على ذلك ، فإن هذه الطريقة لها تأثير ضئيل على التداول الجهازي بسبب التسليم المحلي للعوامل.
تظهر التجارب الحالية أن إعطاء فينيليفرين يؤدي إلى انقباض الشريان السباتي مع انخفاض في تدفق الدم. يوضح التحقيق أعلاه دور مستقبلات ألفا الأدرينالية في تنظيم تدفق دم الشريان السباتي إلى الدماغ. يمكن استخدام هذه التقنية لفحص تأثير المركبات الدوائية المختلفة على تدفق الدم في الوقت الفعلي في الأجنة الحية. يمكن أيضا استخدام القسطرة المحيطة بالأوعية الدموية لغرس فيروس lentivirus في الفضاء حول الأوعية الدموية ، والذي يتم امتصاصه بواسطة الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية أو الإفراط في التعبير عن بروتين أو مستقبل الإشارة المطلوب.
لعقود من الزمان ، قدمت حمامات الأعضاء والأنسجة بيانات مفيدة فيما يتعلق بانقباض الأوعية6،8،9. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات خارج الجسم الحي ، مما يثير تساؤلات بشأن قابلية التكاثر في الجسم الحي ويعني أنه لا يمكن إجراء قياسات مستمرة. للتغلب على هذا القيد ، يفحص هذا النهج المبتكر تدفق دم الشريان السباتي في الجسم الحي. وسيشمل التقدم الإضافي في هذه المنهجية اعتماد التعديل الجيني باستخدام نهج توصيل الفيروس، مما سيسمح بتغيير الأجزاء الشريانية وراثيا لتنظيم التعبير الجيني وتقليله عن طريق توصيل shRNA أو CRISPR/Cas9.
الخطوة الحاسمة في البروتوكول هي وضع القسطرة المحيطة بالأوعية الدموية موازية للوعاء على مقربة. لكي يعمل هذا ، يحتاج المرء إلى معرفة قطر الشريان المستهدف. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تطوير الأكمام المناسبة. يمكن للمرء أن يضع الأكمام المجاورة للشريان المراد تعديله بدلا من محيطه. وسيوفر ذلك أيضا التسليم المحلي للمواد الكيميائية وعوامل الاستهداف.
الحد من هذه الطريقة هو أنها تنظم فقط جزء من الشريان ، ويجب تفسير النتائج المتعلقة بتدفق الدم في الأعضاء أو الأنسجة بعناية. قد يطلب من المرء تغيير طول الأكمام وكمية المواد الكيميائية لتحقيق التأثير المطلوب. هذه الطريقة لها تطبيقات واسعة في تعديل تنظيم الجينات في الأجنة الحية. يمكن تكييف هذا لتعديل وظيفة الجينات والتعبير عنها في جزء من أي نسيج. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق الطريقة لتعديل التعبير الجيني في كائن حي بالغ.
على الرغم من وجود طرق أخرى لقياس تدفق الدم في الجسم الحي ، مثل استخدام مجسات التدفق عبر الصوت10 ، وليزر دوبلر11 ، والمجهرية12 ، لا تسمح أي من هذه الطرق بفحص التأثير المحلي للأدوية على تدفق الدم في الجزء الشرياني بدلا من التأثيرات الجهازية للتدخل. وبالتالي ، فإن الطريقة الحالية فريدة من نوعها ، حيث يمكنها قياس وتعديل تدفق الدم المحلي دون أي آثار جهازية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.
Acknowledgments
تم استخدام الأموال الداخلية من جامعة أريزونا لهذه الدراسات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A.
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
