Summary
O presente protocolo descreve um método para administrar drogas e agentes modificadores da expressão gênica perivascularmente em um feto em desenvolvimento intra-utero . É importante ressaltar que o efeito de drogas/agentes sobre o fluxo sanguíneo pode ser medido com a progressão da gravidez.
Abstract
A capacidade de um organismo de manter um fluxo sanguíneo constante para o cérebro em resposta a picos súbitos de pressão arterial sistêmica (PA) é conhecida como autoregulação cerebral (RCA), que ocorre na artéria carótida. Ao contrário dos recém-nascidos a termo, os prematuros são incapazes de reduzir o fluxo sanguíneo cerebral (FSC) em resposta ao aumento da PA sistêmica. Em neonatos prematuros, isso expõe os frágeis vasos cerebrais a altas pressões de perfusão, levando à sua ruptura e dano cerebral. Estudos ex vivo usando miografia com fio demonstraram que as artérias carótidas de fetos próximos ao termo se contraem em resposta à ativação de receptores alfa1 adrenérgicos. Essa resposta é atenuada no feto prematuro. Assim, para examinar o papel da alfa1-RA in vivo, apresenta-se aqui uma abordagem inovadora para determinar os efeitos de drogas em um segmento arterial carotídeo in vivo em um feto ovino durante a progressão do desenvolvimento da gestação. Os dados apresentados demonstram a mensuração simultânea do fluxo sanguíneo fetal e da pressão arterial. O sistema de liberação perivascular pode ser usado para realizar um estudo de longo prazo durante vários dias. Aplicações adicionais para este método poderiam incluir sistemas de liberação viral para alterar a expressão de genes em um segmento da artéria carótida. Estes métodos podem ser aplicados a outros vasos sanguíneos no organismo em crescimento no útero , bem como em organismos adultos.
Introduction
O nascimento causa estresse ao feto, e há um aumento considerável nos níveis de catecolaminas, o principal hormônio do estresse 1,2. Isso eleva a PA sistêmica e, se essa pressão for transmitida aos frágeis capilares cerebrais através das artérias carótidas, pode levar à sua ruptura 3,4,5. Surtos na PA sistêmica são impedidos de atingir o cérebro pela constrição das artérias carótidas no feto a termo. Entretanto, esse mecanismo não está desenvolvido no feto prematuro, sendo responsável pela probabilidade significativamente maior de lesão cerebral em fetos prematuros 4,5.
Atualmente, não existe um método adequado para examinar a maturação das vias envolvidas na regulação do fluxo sanguíneo carotídeo em fetos em desenvolvimento. Esses estudos sobre fluxo sanguíneo carotídeo e vasorresponsividade são cruciais tanto do ponto de vista científico quanto clínico. Atualmente, para determinar as vias moleculares envolvidas na regulação da contratilidade arterial, o método padrão envolve o isolamento dos segmentos arteriais post-mortem. Em seguida, os experimentos são conduzidos por meio de miografia com fio para determinar a vasocontratilidade de diferentes moléculas farmacológicas que definem as vias regulatórias envolvidas na contratilidade arterial 6,7. É importante notar que os achados ex vivo não são capazes de replicar totalmente o ambiente in vivo devido à regulação do fluxo sanguíneo a montante e a jusante da artéria carótida. Assim, o presente estudo teve como objetivo desenvolver uma técnica que possa determinar os efeitos de substâncias químicas ou agentes vasorresponsivos sobre o fluxo sanguíneo em uma artéria in vivo.
A metodologia de liberação perivascular descrita neste artigo fornece uma abordagem in vivo para estudar o efeito da manipulação farmacológica ou genética de vias de sinalização em diferentes segmentos arteriais. Usando este método, pode-se manipular a pressão arterial fetal e o fluxo sanguíneo carotídeo. Adicionalmente, experimentos com fetos ovinos são demonstrados para estudar os efeitos de moléculas sinalizadoras em um feto em desenvolvimento. Espera-se que a metodologia detalhada fornecida leve a novas investigações no campo dos estudos do fluxo sanguíneo, especialmente em relação à fisiologia e patologia fetal.
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Protocol
Para o presente estudo, a aprovação para os experimentos com animais foi obtida do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Arizona. Foram utilizadas ovelhas Columbia-Rambouillet, gestantes com idade entre 2 e 4 anos de idade, acasaladas temporalmente. Os animais foram obtidos da Unidade de Ovinos da Universidade do Arizona.
1. Manutenção de animais
- Obter animais de qualquer fazenda de ovelhas.
- Transportar as ovelhas para o laboratório aos 105 dias ± 5 dias a 137 dias ± 5 dias de idade gestacional (dGA). Manter os ovinos a uma temperatura de 22 °C ± 1 °C em humidade ambiente. Forneça pellets de alfafa (consulte Tabela de Materiais), sais e água ad libitum.
2. Preparação do material
- Construir o sistema de cateteres perivasculares.
- Junte uma extremidade de 4 pés de tubulação Tygon a um tubo de bomba coletora (MPT) de 2 cm (consulte a Tabela de Materiais). Conecte a outra extremidade do MPT de 2 cm a outro tubo Tygon de 4 pés.
- Faça uma pequena fenda no TMF para que o líquido/agentes possam sair para o espaço perivascular.
- Esterilize as sondas de fluxo (ver Tabela de Materiais), cateteres e uma pequena chave de fenda usando o método de esterilização de gás.
3. Preparo pré-cirúrgico do animal
- Obter aprovação para experimentação animal do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
- Antes da cirurgia, manter as ovelhas em ração zero per os (NPO) por 24 h e água NPO por 16 h. No dia da cirurgia, envolva o rosto da ovelha com um absorvente para proteger os olhos. Raspar o lado esquerdo do pescoço para expor a veia jugular e limpar a pele com iodopovidona e etanol 70%.
- Coloque um cateter intravenoso (IV) na veia jugular da ovelha e fixe-o à pele com fita adesiva impermeável e clipes da ferida (ver Tabela de Materiais).
- Anestesiar as ovelhas com administração IV de diazepam (0,15 mg/kg) e cloridrato de cetamina (16 mg/kg). Administrar uma injeção IM de penicilina G procaína suspensão (25.000 I/kg) e cetoprofeno IV (2,2 mg/kg) (ver Tabela de Materiais).
- Faça a barba no local da incisão da ovelha e nas áreas circundantes (abdômen, flancos e virilha) com cortadores de lâmina #10. Para garantir que a lã seja completamente removida, raspe a área com uma lâmina #40. Lave a área raspada com um limpador germicida (ver Tabela de Materiais) e água. Seque com uma almofada descartável.
- Confirme a profundidade da anestesia (determinada e mantida pela resposta ao pinçamento cutâneo, reflexo corneano e avaliação do tônus mandibular) e, em seguida, intube a ovelha com um tubo endotraqueal de 6,5-7,5 mm de diâmetro interno (ver Tabela de Materiais) e fixe o tubo no lugar. Coloque a ovelha em uma mesa de elevação na posição lateral recumbente e transfira para uma mesa cirúrgica V-top na posição supina.
- Fixe os membros da ovelha à mesa cirúrgica V-top com amarrações cirúrgicas. Traga a ovelha para a posição de Trendelenburg para aliviar a pressão sobre a unidade feto-placentária.
- Anexe uma sonda de oxímetro de pulso (ver Tabela de Materiais) à língua/ouvido da ovelha para monitorizar continuamente a saturação da oxihemoglobina e a frequência cardíaca. Coloque um termômetro sob a língua da ovelha para monitorar a temperatura.
- Conecte o tubo endotraqueal ao circuito respiratório do aparelho de anestesia e inicie a ventilação mecânica enquanto monitora o CO2 expirado.
- Manter a anestesia ajustando o isoflurano entre 2,5%-4% durante toda a cirurgia. Certifique-se de que o animal está adequadamente anestesiado, apertando a orelha. Administrar uma solução poli-iónica balanceada (solução salina a 0,9% p/v) a 5 ml/kg/h utilizando o cateter jugular colocado durante o passo 3.2.1.
- Realizar uma esfoliação estéril. Borrifar a área abdominal e os flancos com solução de povidona (solução de iodo a 10%). Esfregue a área com uma gaze embebida em iodo a partir do local da incisão e trabalhando para fora, certificando-se de não voltar ao centro depois de esfregar para fora.
- Em seguida, borrife a área com etanol (etanol 70% p/v) e esfregue com gaze embebida em etanol de forma semelhante à lavagem com povidona. Repita todo o processo três vezes. Borrife a área com solução de povidona.
- Aqueça o soro fisiológico em um recipiente estéril e leve a 37 °C. Mantenha-o próximo à mesa cirúrgica. Conecte o cautério (ver Tabela de Materiais).
- Peça aos membros da equipe cirúrgica que se vistam com bonés, máscaras faciais e capas de sapato, lavem as mãos (esfoliação cirúrgica) e coloquem aventais e luvas cirúrgicas esterilizadas. A partir daí, uma prática cirúrgica estéril rigorosa deve ser seguida.
- Drape a área abdominal da ovelha esterilizada com toalhas estéreis.
4. Procedimento cirúrgico
- Exteriorização do feto
- Depois de garantir uma profundidade adequada de anestesia, realizar uma incisão laparotomia padrão de 10 cm usando um bisturi (lâmina #20) sobre a linha alba do umbigo até a porção cranial do úbere. Controle o sangramento fazendo uma incisão com um cautério (ajustes de potência: corte 50 e coagulação 25).
- Faça uma pequena incisão através da linha média da parede do corpo abaixo da incisão da pele e abra a cavidade abdominal usando uma tesoura de Metzenbaum (ver Tabela de Materiais).
- Exteriorize o útero contendo o feto através da parede abdominal enquanto coloca toalhas cirúrgicas estéreis por baixo (entre o abdome materno e o útero). Palpar o útero para determinar a posição fetal e os cotilédones. Usando um cautério, faça uma incisão de ~10 cm através da parede uterina com uma grande curvatura sobre o dorso da cabeça, evitando quaisquer vasos sanguíneos visíveis e placentomas.
- Use quatro pinças de Babcock (consulte Tabela de Materiais) para fixar o útero e as membranas placentárias e puxe as pinças de Babcock nos quatro cantos opostos para tornar a cabeça fetal visível. Exteriorizar a metade cranial do feto através desta incisão e cobrir a cabeça fetal com uma luva estéril sem látex preenchida com soro fisiológico quente e estéril (37 °C) para evitar o início da respiração.
- Depois de garantir uma profundidade adequada de anestesia, realizar uma incisão laparotomia padrão de 10 cm usando um bisturi (lâmina #20) sobre a linha alba do umbigo até a porção cranial do úbere. Controle o sangramento fazendo uma incisão com um cautério (ajustes de potência: corte 50 e coagulação 25).
- Instrumentação do cateter perivascular da artéria carótida
- Ao remover a cabeça fetal do útero, peça a um assistente que segure suavemente a pinça de Babcock na vertical para minimizar a perda de líquido amniótico. Com o colo do feto exposto, realizar uma incisão oblíqua de 3-3,5 cm na pele ao longo da borda anterior do músculo esternocleidomastoideo (ECM) em um lado do pescoço na região média e separar a fáscia com pinça de mosquito.
- Divida o platisma e realize uma dissecção ao longo da borda medial do músculo ECM de seu tendão superiormente ao nível do músculo omohioideo inferiormente. A retração do ECM exporá o lençol carotídeo, que contém superficialmente uma veia jugular interna de paredes finas, e abaixo dela estará a artéria carótida como um vaso de paredes espessas.
- Retrair a pele com pinças de Babcock e realizar uma dissecção romba para liberar a artéria carótida do tecido circundante e do lençol carotídeo.
- Retire a sonda de fluxo de 3 mm (consulte Tabela de Materiais) da embalagem estéril, desaparafuse a placa de apoio da sonda e deslize-a para abrir para expor o suporte em L. Levante cuidadosamente a artéria carótida e prenda suavemente o suporte sob o vaso, evitando o contato com o vaso.
- Use pinças para fechar o suporte da sonda de fluxo deslizando suavemente a placa de apoio para uma posição fechada. Fixe o suporte da sonda de fluxo apertando o parafuso de apoio da sonda de fluxo. Para facilitar esse processo, segure suavemente as extremidades da sonda de fluxo com pinças para estabilizar a sonda de fluxo enquanto o parafuso está sendo apertado.
- Pré-lave o cateter perivascular e coloque-o nas proximidades próximas da artéria carótida proximal à sonda de fluxo. Certifique-se de que a fenda aberta do cateter perivascular esteja próxima à artéria carótida.
- Com uma sutura inabsorvível de seda 3-0, fixe as extremidades proximal e distal do sistema perivascular e a sonda de fluxo ao tecido intersticial próximo. Fechar o local da incisão com um ponto contínuo, fechar a pele fetal com uma sutura inabsorvível de seda 3-0 e fixar os cateteres à pele envolvendo a sutura ao redor do cateter três vezes. Retire a luva e coloque a cabeça fetal de volta no útero.
- Ao remover a cabeça fetal do útero, peça a um assistente que segure suavemente a pinça de Babcock na vertical para minimizar a perda de líquido amniótico. Com o colo do feto exposto, realizar uma incisão oblíqua de 3-3,5 cm na pele ao longo da borda anterior do músculo esternocleidomastoideo (ECM) em um lado do pescoço na região média e separar a fáscia com pinça de mosquito.
- Cateterismo do membro fetal
- Exteriorizar a pata traseira do feto. Segure a perna e vire-a para os lados para visualizar a área interna da coxa. Limpar a área com gaze estéril, realizar incisão de 2 cm e expor a artéria femoral. Coloque e fixe a sonda de fluxo seguindo um procedimento semelhante ao feito com a carótida e, em seguida, feche a incisão.
- Faça uma incisão de 2 cm ao longo da face medial da tíbia ~0,5 cm distal ao joelho. Expor a artéria tibial posterior (paredes espessas) e a veia safena (paredes finas). Inserir cateteres de polivinil (diâmetro externo: 1,4 mm e interno: 0,9 mm) na artéria tibial posterior e veia safena usando uma técnica de corte padrão, conforme mencionado abaixo:
- Liberte o vaso de interesse com dissecção romba. Amarrar a porção distal do vaso com uma sutura de seda 3-0 (sem agulha) usando um nó quadrado com três arremessos. Pré-coloque uma segunda gravata sem seda na face proximal do vaso (sob o vaso), mas deixe a ligadura desamarrada. Usando tesoura Castroviejo (ver Tabela de Materiais), faça um pequeno corte transversal no vaso 2 mm proximal à ligadura distal. O comprimento do corte deve ser de ~25% do diâmetro do vaso.
- Restrinja o fluxo sanguíneo do vaso puxando suavemente a sutura proximal e desamarrada. Preencher o cateter com soro fisiológico heparinizado estéril. Insira a extremidade chanfrada do cateter e avance a ponta 20 cm no vaso fetal.
- Segure o cateter no lugar com pinça enquanto um assistente amarra a sutura de seda proximal sem gravata para fixar o vaso ao cateter; Ligar o vaso completamente ao redor do cateter inserido usando nós quadrados a 2 mm do local de inserção com três arremessos. Amarre a ligadura distal proximal à ligação proximal prendendo o vaso ao cateter.
- Fechar a incisão da pele com fio inabsorvível de seda 3-0 com padrão de sutura contínua. Certifique-se de que as suturas estejam amarradas ao redor dos cateteres para evitar restringir o fluxo sanguíneo se puxadas. Coloque um cateter pré-lavado no útero e fixe-o ao feto por uma sutura usando uma sutura de seda inabsorvível 3-0.
5. Colocar o feto de volta e fechar a ferida
- Devolva o feto ao útero. Sutura das membranas fetais com fio de seda inabsorvível 3-0 com padrão de bloqueio contínuo (Cushing). Fechar a camada muscular uterina com fio de seda inabsorvível 3-0.
- Inserir haste cirúrgica de aço inoxidável 18 no subcutâneo ao longo da parede abdominal até a região paracostal. Deixe a extremidade proximal da haste sair do local paracostal realizando uma incisão de 1 cm.
- Conecte os cateteres à extremidade distal da haste cirúrgica e faça com que um assistente alimente os cateteres e o cabo da sonda de fluxo através do local de saída paracostal, empurrando a haste totalmente através da abertura paracostal.
- Fixe todos os cateteres e cabos de sonda de fluxo no local da incisão paracostal. Coloque com fita adesiva impermeável e suture os cateteres à pele da ovelha. Sutura uma bolsa de malha plástica para o exterior da ovelha sobre os cateteres e sonda para armazenar os cateteres.
- Usando um material de sutura absorvível sintético monofilamentar 1-0, fixe a linha alba com um padrão contínuo. Fixar a camada da pele com grampos cirúrgicos.
- Interromper a anestesia geral e extubar a ovelha assim que os reflexos laríngeos voltarem aos valores basais normais. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência completa. Mova a ovelha para o carrinho metabólico quando ela estiver estável após anestesia geral. Retornar o animal à sala de experimentação pós-operatória após a recuperação total da anestesia.
- Administrar analgésicos no pós-operatório por via intravenosa (fenilbutazona 10 mg/kg/dia) por 3 dias. Lavar os cateteres vasculares diariamente com solução salina heparinizada (100 U/mL de heparina em solução de NaCl a 0,9%).
6. Experimentos in vivo pós-operatórios
- Lave os cateteres todos os dias com soro fisiológico heparinizado (75 U/ml). Aguarde 72 h antes de fazer qualquer medição. Para medir o fluxo sanguíneo, conecte as sondas de fluxo inseridas no feto com o módulo de fluxo perivascular ao PowerLab e a um computador conectado.
NOTA: Os registros podem ser feitos no software PowerLab (consulte Tabela de Materiais) para medir o fluxo sanguíneo carotídeo e femoral. Faça a medição basal por 30 min. - Conecte os cateteres arterial e amniótico ao amplificador de ponte conectado a um conversor analógico-digital (consulte a Tabela de Materiais). Administrar um bolus de 1 mL de fenilefrina 10 uM ao feto por via intravenosa e medir o fluxo carotídeo e femoral por 15 min. Em seguida, aguarde 30 min ou até que o fluxo sanguíneo retorne aos valores basais.
- Infundir 1 mL de fenilefrina 10 uM no cateter perivascular e medir o fluxo sanguíneo por 15 min. Lave a fenilefrina administrando 5 mL de soro fisiológico morno através do cateter perivascular. Em seguida, aguarde 30 min ou até que o fluxo sanguíneo retorne aos valores basais.
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Representative Results
Para examinar a manipulação localizada in vivo do fluxo sanguíneo, 1 mL de fenilefrina (10 μM), um agonista α1-AR, foi administrado no espaço perivascular da artéria carótida por um cateter de infusão exteriorizado para determinar o efeito sobre o fluxo sanguíneo carotídeo local e o efeito sobre a pressão arterial sistêmica. A Figura 1A demonstra uma redução significativa no fluxo sanguíneo carotídeo sem qualquer efeito sobre a pressão arterial sistêmica em ovinos fetais de curto prazo. A Figura 1B mostra os mesmos dados para um feto prematuro. A administração de 1 mL de EPS por via IV aumentou o fluxo sanguíneo sistêmico sem afetar o fluxo sanguíneo carotídeo em ovinos fetais próximos ao termo (Figura 1C). A Figura 1D mostra os mesmos dados para um feto prematuro. Em contraste, a administração de PHE por cateter perivascular não teve efeito em ovinos prematuros; entretanto, a administração por via intravenosa causou aumento significativo tanto do fluxo sanguíneo carotídeo quanto da PA sistêmica. Este experimento demonstra uma manga perivascular totalmente funcional que pode regular o fluxo sanguíneo na artéria carótida in utero sem afetar a PA sistêmica. Os resultados mostram que fetos prematuros não respondem à regulação do fluxo sanguíneo carotídeo mediada por fenilefrina; entretanto, a resposta é madura em fetos próximos ao termo (Figura 1E). É importante ressaltar que a administração IV de EPF aumentou o fluxo sanguíneo carotídeo apenas em fetos prematuros, sem efeito significativo em fetos próximos ao termo (Figura 1G). Entretanto, a administração endovenosa de EPF elevou a pressão arterial sistêmica tanto em fetos prematuros quanto próximos ao termo (Figura 1H). Os resultados também demonstram que a instilação perivascular de fenilefrina não teve efeito sobre a pressão arterial sistêmica (Figura 1F).
Figura 1: Manipulação in vivo do fluxo sanguíneo. Um traço exemplar de medidas basais de pressão arterial sistêmica e fluxo sanguíneo carotídeo e alterações após a administração de fenilefrina (PHE) através do cateter perivascular de (A) um feto in utero de curto prazo e (B) um feto prematuro in utero . Um traço exemplar de pressão arterial sistêmica e fluxo sanguíneo da artéria carótida, medidas basais e alterações após a administração intravenosa de fenilefrina (PHE) de (C) um feto in utero a curto prazo e (D) um feto prematuro in utero . As mudanças na (E) porcentagem do fluxo sanguíneo carotídeo e (F) pressão arterial sistêmica através do sistema de liberação do cateter perivascular para ovinos próximos a termo e prematuros são mostradas. As alterações na porcentagem (G) do fluxo sanguíneo carotídeo e (H) pressão arterial sistêmica via administração sistêmica para ovinos de curto prazo e prematuros são mostradas. As barras de erro demonstram o erro padrão da média. N = 4 em cada grupo. *P < 0,05 pelo teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Atualmente, não existe um método para examinar a contratilidade e dilatação vascular in vivo em resposta a compostos de drogas e manipulação gênica. Como padrão no campo, o fluxo sanguíneo in vivo é medido por sondas de fluxo Doppler, microesferas e moléculas radioativas, como água tritiada. No entanto, para manipular as funções dos receptores ou a sinalização a jusante, os animais são sacrificados, e experimentos são realizados in vitro em banhos de órgãos após o isolamento dos segmentos arteriais. Os métodos atuais fornecem uma maneira de conduzir manipulações in vivo de segmentos arteriais, introduzindo substâncias químicas ou vetores para modificar a expressão gênica. Além disso, esse método tem um efeito mínimo sobre a circulação sistêmica devido à liberação local dos agentes.
Os experimentos atuais demonstram que a administração de fenilefrina resulta na constrição da artéria carótida com redução do fluxo sanguíneo. A investigação acima elucida o papel dos receptores alfa-adrenérgicos na regulação do fluxo sanguíneo da artéria carótida para o cérebro. Esta técnica pode ser usada para examinar o efeito de diferentes compostos farmacológicos sobre o fluxo sanguíneo em tempo real em fetos vivos. O cateter perivascular também pode ser usado para instilar lentivírus no espaço perivascular, que é absorvido pela vasculatura, para resultar no knockdown ou superexpressão da proteína ou receptor sinalizador desejado.
Durante décadas, o banho de órgãos e tecidos forneceu dados úteis quanto à contratilidade dos vasos6,8,9. No entanto, esses estudos são ex vivo, o que levanta questões sobre a reprodutibilidade in vivo e significa que medidas contínuas não podem ser realizadas. Para superar essa limitação, essa abordagem inovadora examina o fluxo sanguíneo da artéria carótida in vivo. Um avanço adicional nesta metodologia incluirá a adoção de modulação genética usando abordagens de entrega de vírus, o que permitirá que segmentos arteriais sejam geneticamente alterados para upregulate e downregulation expressão gênica através da entrega de shRNA ou CRISPR/Cas9.
O passo crítico do protocolo é colocar o cateter perivascular paralelo ao vaso em estreita proximidade. Para que isso funcione, é preciso saber o diâmetro da artéria alvo. Além disso, desenvolver uma manga adequada é importante. Pode-se colocar a manga adjacente à artéria a ser modulada em vez de circundá-la. Isso também proporcionará a entrega local dos produtos químicos e agentes de segmentação.
A limitação do método é que ele regula apenas um segmento da artéria, e os resultados referentes ao fluxo sanguíneo de órgãos ou tecidos devem ser interpretados com cautela. Pode-se ser necessário alterar o comprimento da manga e a quantidade de produtos químicos para alcançar o efeito desejado. O método tem amplas aplicações na modulação da regulação gênica em fetos vivos. Isso pode ser adaptado para modular a função e a expressão gênica em uma porção de qualquer tecido. Adicionalmente, o método pode ser aplicado para modular a expressão gênica em um organismo adulto.
Embora existam outros métodos para medir o fluxo sanguíneo in vivo , como o uso de sondas de fluxo transônicas10, laser Doppler11 e microesferas12, nenhum desses métodos permite examinar o efeito local dos fármacos sobre o fluxo sanguíneo no segmento arterial, em oposição aos efeitos sistêmicos da intervenção. Assim, o método atual é único, pois pode medir e modular o fluxo sanguíneo local sem efeitos sistêmicos.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações.
Acknowledgments
Fundos intramuros da Universidade do Arizona foram usados para esses estudos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
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