Isolamento, attivazione ed espansione delle cellule T basate sulla flottazione da campioni di cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando microbolle
Summary
L’obiettivo di questo studio è dimostrare la fattibilità della separazione basata sulla flottazione per isolare, attivare ed espandere le cellule T umane primarie.
Abstract
Il processo di isolamento delle cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per stabilire colture ex vivo è cruciale per la ricerca, i test clinici e le terapie basate sulle cellule. In questo studio, viene presentato un protocollo semplice e nuovo per isolare, attivare ed espandere le cellule T dalle PBMC ex vivo . Questo studio utilizza la tecnologia di selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) funzionalizzata per isolare e attivare le cellule T. In breve, il protocollo prevede la selezione positiva di cellule CD3+ da PBMC derivate da leukopak, seguita da una co-stimolazione di 48 ore con microbolle di streptavidina pre-coniugate anti-CD28-legate (SAMB) prima della trasduzione in piastre a 24 pozzetti. Le microbolle funzionalizzate offrono un’opportunità unica per attivare le cellule, portando a fenotipi proliferativi che consentono l’espansione con un esaurimento minimo. Questa tecnica offre un esaurimento ridotto perché le microbolle co-stimolatorie rimangono galleggianti e ritornano in cima al terreno di coltura, riducendo così la quantità di tempo in cui le cellule in espansione sono in contatto con i fattori co-stimolatori. I risultati indicano che le cellule T isolate e coltivate ricevono una stimolazione sufficiente per attivarsi e proliferare ma non in misura tale da portare a una sovraattivazione, che porta quindi all’esaurimento, come dimostrato dalla presenza di PD-1 eccessivo.
Introduction
Più di 500 studi clinici sulla terapia cellulare del recettore dell’antigene chimerico (CAR)-T sono attualmente condotti in tutto il mondo e quattro prodotti di terapia cellulare CAR-T sono disponibili sul mercato1. Tuttavia, esistono ancora numerose esigenze di ricerca e produzione di cellule CAR-T che devono essere affrontate per migliorare l’efficacia, la scalabilità e il successo a lungo termine di queste terapie potenzialmente curative 2,3,4,5. La ricerca clinica e la produzione di cellule CAR-T adottive inizia con l’isolamento delle cellule T da un campione di sangue periferico e la successiva stimolazione, trasduzione ed espansione delle cellule isolate. Parametri come il recupero delle cellule T, la purezza e i segnali di attivazione/esaurimento richiedono un’attenta considerazione quando si scelgono le tecniche di isolamento e stimolazione cellulare per la ricerca e la produzione di cellule CAR-T 3,4,6. È importante sottolineare che è necessario migliorare la persistenza terapeutica delle terapie cellulari CAR-T riducendo al minimo gli impedimenti biologici derivanti dagli attuali processi di produzione, come l’esaurimento delle cellule T, per migliorare l’efficacia terapeutica 6,7.
In alternativa ai tradizionali metodi di isolamento cellulare come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS), qui viene dimostrata la selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) con microbolle per l’isolamento delle cellule T. La separazione delle microbolle utilizza microsfere galleggianti e cave (microbolle) per legare i bersagli e farli galleggiare sulla superficie dei campioni di fluido 8,9. Funzionalizzando le microbolle con anticorpi (cioè anti-CD3), le popolazioni di cellule T desiderate possono essere selezionate positivamente da campioni di sangue periferico. Successivamente, in questo lavoro viene dimostrato l’uso di una diversa popolazione di microbolle funzionalizzate con anticorpi (cioè anti-CD28) per co-stimolare e attivare cellule T selezionate positivamente in sospensione. Le microbolle offrono un flusso di lavoro di isolamento e attivazione semplice e altamente sintonizzabile che genera cellule T pronte per la coltura cellulare sospesa e applicazioni a valle come la modificazione genetica e l’espansione. Criticamente, l’attivazione cellulare galleggiante con microbolle promuove la stimolazione cellulare trattenuta per prevenire un eccessivo esaurimento delle cellule T7.
Per questo studio, la citometria a flusso è stato lo strumento principale utilizzato per analizzare l’isolamento, l’attivazione e il successo della trasduzione delle microbolle funzionalizzate, nonché per fornire informazioni dettagliate sulle sottopopolazioni specifiche presenti durante le fasi di crescita ed espansione post-trasduzione. Oltre alla citometria a flusso, sono stati utilizzati microscopi a campo chiaro e a fluorescenza per confermare la salute cellulare, la morfologia e il successo della trasduzione. Sulla base di questi risultati, la tecnologia e il protocollo a microbolle forniscono un’alternativa più sintonizzabile e delicata ai tradizionali metodi di isolamento e attivazione attualmente in uso; in particolare, le cellule attivate da microbolle mostrano un’espressione notevolmente inferiore dei marcatori di esaurimento delle cellule T rispetto a quella tipicamente osservata con strumenti e kit standard del settore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto consente l’isolamento delle cellule T da campioni di PBMC e l’attivazione di cellule T sospese in terreni di coltura con microbolle. Questo metodo si basa su microbolle funzionalizzate la cui galleggiabilità intrinseca offre un’opportunità unica per introdurre segnali co-stimolatori alle cellule e attivarli mentre sono sospesi in un terreno di coltura, riducendo così l’esposizione delle cellule in espansione alla stimolazione prolungata; tale sovrastimolazione può comportare un aumento dell’es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
