태아 마우스의 구조적 심장 결함을 특성화하는 파이프라인
Summary
이 기사에서는 태아 심 초음파, 부검 및 episcopic confocal 현미경 (ECM)을 사용한 episcopic 형광 이미지 캡처 (EFIC)를 사용한 쥐 선천성 심장병 (CHD) 진단 방법에 대해 자세히 설명합니다.
Abstract
선천성 심장병 (CHD)은 미국에서 유아 사망의 주요 원인입니다. 1980 년대와 그 이전에 중등도 또는 중증 CHD 환자는 성인이되기 전에 사망했으며 생후 첫 주 동안 최대 사망률을 보였습니다. 수술 기술, 진단 접근법 및 의료 관리의 놀라운 발전으로 결과가 크게 개선되었습니다. 선천성 심장 결함을 이해하는 중요한 연구 요구를 해결하기 위해 쥐 모델은 인간과 심장 해부학이 매우 유사하고 임신 속도가 짧기 때문에 이상적인 연구 플랫폼을 제공했습니다. 유전 공학과 고 처리량 표현형 도구의 결합은 구조적 심장 결함의 복제 및 진단을 통해 CHD 뒤에있는 분자 경로를 더 자세히 설명 할 수있었습니다. 3차원(3D) 재구성을 통해 에피스코프 컨포칼 현미경(ECM) 조직병리학을 사용한 고충실도의 에피스코픽 형광 이미지 캡처(EFIC)와 결합된 마우스 모델의 심장 표현형을 스크리닝하기 위한 비침습적 태아 심초음파를 사용하면 다양한 선천성 심장 결함의 해부학에 대한 자세한 보기가 가능합니다. 이 프로토콜은 쥐 선천성 심장 결함의 정확한 진단을 얻기 위해 이러한 방법의 완전한 워크 플로우를 설명합니다. 이 표현형 프로토콜을 모델 유기체에 적용하면 정확한 CHD 진단이 가능하여 CHD 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. CHD의 기본 메커니즘을 확인하는 것은 잠재적인 치료법과 개입의 기회를 제공합니다.
Introduction
선천성 심장 질환(CHD)은 가장 흔한 신생아 선천적 결함1,2으로 신생아의 약 0.8%-1.7%에 영향을 미치고 상당한 신생아 사망률과 이환율3을 초래합니다. 유전 적 병인은 CHD 4,5로 강력하게 나타납니다. 유전자 변형 마우스 모델은 CHD의 복잡성과 마우스와 인간 태아에서 4 개의 챔버 심장과 유사한 심장 발달 DNA 서열을 갖는 마우스로 인해 CHD를 유발하는 메커니즘을 이해하기 위해 널리 사용되었습니다6. 마우스 돌연변이체의 표현형을 확인하는 것은 표적 유전자의 기능을 특성화하는 기본적인 첫 번째 단계입니다. 단일 유전자 돌연변이가 인간 CHD를 모방하는 심장 결함의 스펙트럼을 초래할 수있는 유전자 투여 효과를 나타내는 마우스 모델은 CHD의 복잡성과이를 유발하는 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다.
이 문서에서는 마우스 모델에서 심장 표현형을 특성화하는 파이프라인을 간략하게 설명합니다. 적용된 방법은 태아 심 초음파 7, 부검 및 ECM 조직 병리학 7,8을 사용하여 쥐 심장 표현형 발달의 상세한 해부학을 표시 할 수 있습니다. 태아 심 초음파는 합리적인 이미징 해상도로 여러 배아를 직접 시각화 할 수있는 비 침습적 양식입니다. 또한 태아 심 초음파는 깔짚에있는 배아의 총 수, 발달 단계, 자궁 뿔의 상대적 방향과 위치를 신속하게 결정합니다. 스펙트럼 도플러 / 색상 흐름을 사용하여 구조, 혈역학 적 장애, 성장 제한 또는 수종의 발달을 기반으로 비정상적인 배아를 식별 할 수 있습니다. 태아 심 초음파 연구는 비 침습적 기술이기 때문에 여러 날에 스캔하고 혈류 역학 또는 심장 형태의 변화를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 태아 심 초음파의 고품질 영상을 얻으려면 경험과 지식 부족으로 인해 특정 심장 결함을 놓칠 수 있으므로 연습과 기술이 필요합니다. 이 때문에 부검과 ECM 조직 병리학의 조합을 통해 심장 형태에 대한보다 확실한 분석을 얻을 수 있습니다. 부검은 아치 구조, 대동맥과 폐동맥의 상대적 관계, 심실과 심방의 크기, 가슴에 대한 심장의 위치 및 기관지 폐 구조의 직접적인 시각화를 제공합니다. 그러나 심장 판막 및 벽 두께와 같은 내부 특징은 부검만으로는 평가하기 어려울 수 있습니다. 따라서 결정적인 진단을 위해서는 ECM 조직 병리학이 권장됩니다. ECM 조직병리학은 이미지 스택(9)의 2D 및 3D 재구성 모두를 허용하는 고해상도 시각화 기술이다. 이 이미지는 파라핀이 포매된 샘플의 연속 Episcopic 형광 이미징을 통해 얻어지며, 자동 마이크로톰에 의해 일정한 간격으로 얇게 절단됩니다. 고전적인 조직학과 달리 이미지는 블록에서 절단되기 전에 섹션으로 캡처되어 모든 이미지가 동일한 참조 프레임 내에서 캡처됩니다. 이 때문에 ECM 조직 병리학에 의해 생성 된 2D 이미지 스택은 쉽고 안정적으로 3 차원으로 재구성 될 수 있습니다. 이것은 DICOM 뷰어를 사용하여 수행되며, 이를 통해 관상, 시상 및 횡단의 세 가지 해부학적 평면에서 이미지를 3D 시각화할 수 있습니다. 이러한 고해상도 3D 재구성으로부터 결정적인 심장 진단이 이루어질 수 있습니다. 이 세 가지 시각화 양식을 개별적으로 또는 조합하여 적용하면 마우스 배아의 구조적 심장 결함에 대한 정확한 특성을 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전자 변형 마우스는 선천성 심장 결함의 병리 메커니즘을 이해하는 데 사용되었습니다. 이 연구에서 우리가 제공하는 프로토콜은 쥐 태아 심장 결함을 평가하는 과정을 간소화하고 표준화하려고 시도합니다. 그러나 프로토콜 중에 주의해야 할 중요한 단계가 있습니다. 마우스 배아는 임신 기간 동안 크게 자라며 태아 심 초음파를 정확하게 수행하여 마우스를 수확하는 정확한 시간을 결정할 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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