כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת בדיקה אימונוסורבית המקושרת לאנזים סנדוויץ’ שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של שרידי מלכודת חוץ-תאיים של נויטרופילים, מיילאופרוקסידז מצומד-DNA וקומפלקסים של דנ”א מצומד אלסטאז נויטרופילים, הנגזרים מנויטרופילים פעילים.

Abstract

גירויים מסוימים, כגון מיקרואורגניזמים, גורמים לנויטרופילים לשחרר מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs), שהם בעצם מבנים דמויי רשת המורכבים מדנ”א עם חלבוני גרגירים, כגון myeloperoxidase (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE), וחלבונים ציטופלזמיים וציטו-שלד. למרות שהעניין ב- NETs גדל לאחרונה, אין שיטת בדיקה רגישה ואמינה זמינה למדידת NETs במסגרות קליניות. מאמר זה מתאר בדיקה אימונוסורבנטית המקושרת לאנזים סנדוויץ’ שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של NETs במחזור, MPO-DNA וקומפלקסים NE-DNA, שהם רכיבים ספציפיים של NETs ומשוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs. הבדיקה משתמשת בנוגדנים חד-שבטיים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. MPO או NE נקשר לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. בדיקה זו מראה ליניאריות טובה ודיוק גבוה בין בדיקות ותוך מבחנים. השתמשנו בו ב-16 חולי COVID-19 עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה נלווית ומצאנו כי ריכוזי ה-MPO-DNA וה-NE-DNA בפלזמה היו גבוהים משמעותית מאשר בפלזמה שהתקבלה מקבוצת ביקורת בריאה. בדיקת זיהוי זו היא שיטה אמינה, רגישה ביותר ושימושית לחקירת המאפיינים של NETs בפלזמה אנושית ובתרבית-על.

Introduction

מאמר זה מתאר שיטה לכימות היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים (NET) בנוזלים ביולוגיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים סנדוויץ’ (ELISA) כדי לזהות קומפלקסים של מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE) עם DNA ^1,2. NETs מורכבים מעמוד שדרה של DNA המעוטר בפרוטאזות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בגרגרי נויטרופילים ^3,4. הן קומפלקסים MPO-DNA והן NE-DNA הם מרכיבים חשובים וספציפיים של NETs והם משוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs ^3,4.

מלבד תפקידם הפיזיולוגי החשוב בהגנה אנטי-מיקרוביאלית³, ל-NETs יש גם השפעות פתולוגיות שונות^4,5, כולל קידום טרומבוגנזה⁶ והחמרה באלח דם⁷. בהתאם לכך, רשתות צוברים תשומת לב לאחרונה. עם זאת, כימות in vivo של NETs הוכח כמאתגר בשל היעדר שיטת בדיקה כמותית רגישה ואמינה.

קיימות מספר שיטות, כולל מדידה ישירה של NETs במיקרוסקופ פלואורסצנטי^8,9 וציטומטריית זרימה 10 ומדידה עקיפה של דנ”א נטול תאים במחזור, נוקלאוזומים והיסטון H3 ציטרולינציה^, אך לכל שיטה יתרונות ומגבלות משלה¹¹. למרות שהשיטה המיקרוסקופית האימונופלואורסצנטית היא ספציפית ל- NETs ומראה בבירור את הלוקליזציה ואת מידת היווצרות ה- NET, הדגימות מוגבלות לרקמת ביופסיה וחומרים מופרשים. יתר על כן, שיטה זו צריכה להתבצע על ידי חוקרים מיומנים ודורשת זמן רב לקבלת תוצאות. מדידת רמות במחזור של רכיבים הקשורים ל- NET באמצעות ציטומטריית זרימה היא קלה ומספקת תוצאות במהירות; עם זאת, השיטה אינה ספציפית ל- NETs¹².

אנו¹³ ואחרים^1,2 פיתחנו בדיקה רגישה ואמינה ביותר למדידת רכיבי NET במחזור, MPO-conjugated או NE-conjugated DNA^, בפלזמה אנושית עם טכניקת ELISA שונה המשתמשת בנוגדנים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. בדיקה זו יכולה לשמש גם ex vivo כדי לזהות רכיבי NET בסופרנאטנטים של תרביות תאים המשתחררים על ידי נויטרופילים פעילים בתגובה לגירוי phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם להצהרת הלסינקי ואושר על ידי מועצות הסקירה המוסדיות של האוניברסיטה הרפואית אאיצ’י (2017-H341, 2019-H137). התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל משתתף. 1. הכנת מגיב הערה: כדי לבצע את בדיקת הכריך ELISA, הריאגנטים מוכנים כמתואר להלן. חיץ ציפוי:כדי ליצ…

Representative Results

שיטה זו השתמשה בכריך ELISA עם נוגדנים חד-שבטיים אנטי-MPO, אנטי-NE ואנטי-דנ”א כדי למדוד דנ”א הקשור ל-MPO ול-NE (איור 1). בשיטה זו, הבארות של צלחת מיקרוטיטר צופו בנוגדן חד-שבטי ספציפי ל-MPO או NE ספציפי כדי ללכוד MPO הקשור ל-DNA ו-NE הקשור ל-DNA, כמו גם MPO ו-NE שאינם קשורים ל-DNA. כדי לחשב את מקדם השונות ?…

Discussion

תיארנו שיטת סנדוויץ’ ELISA שבה MPO או NE נקשרים לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. לאחר השטיפה, “הכריך” הושלם על ידי דגירה של הדגימות עם נוגדן חד שבטי הקשור לפרוקסידז נגד DNA. לאחר הסרת נוגדן משני לא קשור, מצומד הפרוקסידז הכבול מזוהה על ידי תוספת של מצ…

Materials

1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.