Summary

3-D покадровая визуализация динамики клеточной стенки с использованием калькофтора в Моховом Фискомитриум Патенсе

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

В этой рукописи представлен подробный протокол для изображения динамики 3-D клеточной стенки живой ткани мха, что позволяет визуализировать отслоение клеточных стенок у мутантов ggb и утолщение паттернов клеточных стенок в диком типе во время развития в течение длительного периода.

Abstract

Покадровая визуализация с флуоресцентной микроскопией позволяет наблюдать динамические изменения роста и развития на клеточном и субклеточном уровнях. В целом, для наблюдений в течение длительного периода метод требует трансформации флуоресцентного белка; однако для большинства систем генетическая трансформация либо отнимает много времени, либо технически недоступна. В этой рукописи представлен протокол для 3-D покадровой визуализации динамики клеточной стенки в течение 3-дневного периода с использованием калькофторового красителя (который окрашивает целлюлозу в клеточную стенку растения), разработанного во мхе Physcomitrium patens. Сигнал калькофторового красителя от клеточной стенки стабилен и может длиться в течение 1 недели без явного распада. С помощью этого метода показано, что отслойка клеток у мутантов ggb (при которой выбавливается бета-субъединица белка геранилгеранилтрансферазы-I) вызвана нерегулируемым расширением клеток и дефектами целостности клеточной стенки. Кроме того, паттерны окрашивания калькфтором меняются с течением времени; менее интенсивно окрашенные области коррелируют с будущими участками расширения/ветвления клеток в диком типе. Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.

Introduction

Клеточные стенки растений претерпевают динамические изменения при расширении и развитии клеток 1,2,3. Поддержание целостности клеточной стенки имеет решающее значение для адгезии растительных клеток во время роста и развития, а также для реакции на сигналы окружающей среды. Хотя визуализация динамики клеточной стенки живых клеток в течение длительного периода времени имеет решающее значение для понимания того, как клеточная адгезия поддерживается во время развития и адаптации к изменениям окружающей среды, современные методы непосредственного наблюдения динамики клеточной стенки все еще сложны.

Покадровая визуализация клеточных изменений может обеспечить информативную динамику развития организма с помощью флуоресцентного микроскопа высокого разрешения 4,5,6,7. В то время как покадровая 3D-визуализация имеет большой потенциал для изучения динамических изменений формы клеток во время роста и развития, метод обычно требует преобразования флуоресцентного белка 4,5,6,7. Однако для большинства систем генетические трансформации либо отнимают много времени, либо технически сложны. В качестве альтернативы уже давно доступны флуоресцентные красители, которые прикрепляются к клеточным компонентам. Флуоресцентные красители могут излучать флуоресцентный свет после облучения светом определенной длины волны. Распространенными примерами являются Edu, DAPI, PI, FM4-64 и кальцифтор белый 8,9,10. Одним из основных недостатков, однако, является то, что эти красители обычно могут использоваться только в фиксированной ткани или для коротких экспериментов, отчасти из-за вреда, который они наносят клетке 8,9,10.

Согласно протоколу, представленному здесь, сигналы калькофтора стабильны, когда белый калькофтор смешивается в среде во время покадровых экспериментов во мхе P. patens. Используя этот метод, отслоение клеток у мутантов ggb с использованием 3-D покадровой визуализации наблюдалось в течение 3-дневного периода3 (рисунок 1). Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Список материалов и оборудования см. в Таблице материалов , а в Таблице 1 – список решений, которые будут использоваться в настоящем протоколе. 1. Подготовка растений для стеклянной нижней посуды Выращивайте протонемальную ткан…

Representative Results

Этот метод позволяет наблюдать динамику клеточной стенки во время развития у мутантов дикого типа и ggb (рисунок 1). Результаты показали, что области с меньшим утолщением клеточной стенки коррелируют с участками расширения/ветвления клеток, что позволяет прогнозиро?…

Discussion

Покадровая 3D-реконструкция, или 4-D визуализация, является мощным инструментом для наблюдения за динамикой клеточной морфологии во время процессов развития. В этом протоколе, путем смешивания белого калькофтора в среде, динамика морфологии 3-D клеток может наблюдаться у мха P. patens. И?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят доктора Суси Патрисию и Бетти Нанн из Университета Луисвилля за помощь с конфокальным микроскопом. Эта работа финансировалась Национальным научным фондом (1456884 до M.P.R.) и Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда (1849213 m.P.R.).

Materials

3-mm-thick red plastic light filter  Mitsubishi  no.102
27 mm diameter glass base dish  Iwaki 3930-035
Agar  Sigma A6924
Calcofluor white   Sigma 18909-100ML-F Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope  Nikon  A1

NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Fluorescence microscope  Nikon  TE200  Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum  Nacali Tesque 12389-96
Plant Growth Chambers SANYO  Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter Millipore SLGV033RS

References

  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).

Play Video

Cite This Article
Bao, L., Running, M. P. 3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens. J. Vis. Exp. (192), e64651, doi:10.3791/64651 (2023).

View Video