Summary

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

Abstract

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מאופיינות במערך משתנה מאוד של פגמים מבניים וליקויים קוגניטיביים הנובעים מחשיפה לאתנול לפני הלידה. בשל הפתולוגיה המורכבת של FASD, מודלים של בעלי חיים הוכיחו את עצמם כקריטיים להבנתנו הנוכחית של פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול. דגי זברה הוכיחו את עצמם כמודל רב עוצמה לבחינת פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול בשל רמת השימור הגבוהה הן של גנטיקה והן של התפתחות בין דגי זברה לבני אדם. כמערכת מודל, לדגי זברה יש תכונות רבות שהופכות אותם לאידיאליים למחקרים התפתחותיים, כולל מספר רב של עוברים מופרים חיצונית שהם ניתנים למשיכה גנטית ושקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט במדויק על העיתוי והמינון של חשיפה לאתנול בהקשרים גנטיים מרובים. אחד הכלים הגנטיים החשובים הזמינים בדגי זברה הוא טרנסגנזה. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים והקמת קווים טרנסגניים יכולה להיות מורכבת וקשה. כדי להתמודד עם בעיה זו, חוקרי דגי זברה הקימו את מערכת הטרנסגנזה Tol2 המבוססת על טרנספוזון. מערכת מודולרית זו משתמשת בגישת שיבוט שער מרובה אתרים להרכבה מהירה של מבנים טרנסגניים שלמים מבוססי טרנספוזון Tol2. במאמר זה אנו מתארים את ארגז הכלים הגמיש של מערכת Tol2 ופרוטוקול ליצירת מבנים טרנסגניים המוכנים לטרנסגנזה של דגי זברה והשימוש בהם במחקרי אתנול.

Introduction

חשיפה לאתנול טרום לידתי מולידה רצף של ליקויים מבניים וליקויים קוגניטיביים המכונים הפרעות ספקטרום אלכוהול עוברי (FASD)1,2,3,4. היחסים המורכבים בין גורמים מרובים הופכים את לימוד והבנת האטיולוגיה של FASD בבני אדם למאתגרים. כדי לפתור את האתגר הזה, נעשה שימוש במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים. הכלים הביולוגיים והניסיוניים הזמינים במודלים אלה הוכיחו את עצמם כחיוניים לפיתוח הבנתנו את הבסיס המכניסטי של טרטוגניות אתנול, והתוצאות ממערכות מודל אלה תואמות להפליא את מה שנמצא במחקרי אתנול אנושיים 5,6. בין אלה, דגי זברה התפתחו כמודל רב עוצמה לחקר אתנול טרטוגנזה7,8, בין היתר בשל ההפריה החיצונית שלהם, פריון גבוה, יכולת משיכה גנטית ועוברים שקופים. עוצמות אלה משתלבות והופכות את דגי הזברה לאידיאליים למחקרי הדמיה חיים בזמן אמת של FASD באמצעות קווי דגי זברה טרנסגניים.

דגי זברה טרנסגניים שימשו באופן נרחב לחקר היבטים רבים של התפתחות עוברית9. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים וקווים טרנסגניים הבאים יכולה להיות קשה מאוד. טרנסגן סטנדרטי דורש אלמנט מקדם פעיל כדי להניע את הטרנסגן ואות פולי A או “זנב”, כולם בווקטור חיידקי יציב לתחזוקה וקטורית כללית. הדור המסורתי של מבנה מהונדס מרובה רכיבים דורש שלבי שיבוט משנה מרובים הגוזלים זמן רב10. גישות מבוססות PCR, כגון הרכבת גיבסון, יכולות לעקוף חלק מהבעיות הקשורות לשיבוט משנה. עם זאת, פריימרים ייחודיים חייבים להיות מתוכננים ונבדקים עבור הדור של כל מבנה מהונדס ייחודי10. מעבר לבניית טרנסגנים, אינטגרציה גנומית, העברת תאי נבט וסינון לאינטגרציה טרנסגנית תקינה היו קשים גם כן. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לשימוש במערכת טרנסגנזה מבוססת טרנספוזון Tol2 (Tol2Kit)10,11. מערכת מודולרית זו משתמשת בשיבוט שער מרובה אתרים כדי ליצור במהירות מבנים טרנסגניים מרובים מספרייה הולכת ומתרחבת של וקטורי “כניסה” ו”יעד”. אלמנטים משולבים הניתנים לטרנספוזיה Tol2 מגבירים מאוד את קצב הטרנסגנזה, ומאפשרים בנייה מהירה ואינטגרציה גנומית של טרנסגנים מרובים. באמצעות מערכת זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש ביצירת קו דגי זברה טרנסגניים של אנדודרם כדי לחקור את הפגמים המבניים הספציפיים לרקמות העומדים בבסיס FASD. בסופו של דבר, בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההתקנה המודולרית והבנייה של מבנים טרנסגניים יסייעו מאוד למחקר FASD מבוסס דגי זברה.

Protocol

כל עוברי דגי הזברה המשמשים בהליך זה גודלו וגודלו בעקבות פרוטוקולים שנקבעו12 של IACUC. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת לואיוויל. הערה: במחקר זה נעשה שימוש בזן דגי הזברה מסוג בר, AB וקו מוטנטי כפול bmp4st72;smad5b1100 . כל המים ששימשו בהליך זה היו מי אוסמ…

Representative Results

כדי ליצור את המבנים הטרנסגניים, השתמשנו במערכת הטרנסגנזה Tol2. שלושה וקטורי כניסה, כולל p5E, המחזיק את האלמנטים מקדם/משפר הגנים, pME, המחזיק את הגן לביטוי על ידי האלמנטים המקדם/משפר, ו-p3E, אשר לכל הפחות, מחזיק את זנב הפוליA, שימשו ליצירת המבנה המהונדס באמצעות שיבוט LR מרובה אתרים. וקטור היעד, pDest…

Discussion

דגי זברה מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של חשיפה לאתנול על התפתחות ומצבי מחלות 7,8. דגי זברה מייצרים מספר רב של עוברים שקופים, מופרים חיצונית וניתנים למשיכה גנטית, מה שמאפשר הדמיה חיה של מספר רקמות וסוגי תאים המסומנים בטרנסגנים בו זמנית בהקשרים סביבתיים מ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר המוצג במאמר זה נתמך על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי לשימוש לרעה באלכוהול (NIH/NIAAA) R00AA023560 ל- C.B.L.

Materials

Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawsone Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

References

  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
  14. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  15. Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  16. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  17. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  18. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
  19. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
  20. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  23. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  24. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Play Video

Cite This Article
Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

View Video