Preparazione della sospensione unicellulare dall'intestino della tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula
Summary
Qui, dimostriamo la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell’intestino di tilapia per il sequenziamento unicellulare.
Abstract
La tilapia del Nilo è una delle specie di pesci d’acqua dolce più comunemente coltivate in tutto il mondo ed è un modello di ricerca ampiamente utilizzato per gli studi sui pesci di acquacoltura. La preparazione di sospensioni monocellulari di alta qualità è essenziale per gli studi a livello di singola cellula come l’RNA a singola cellula o il sequenziamento del genoma. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all’uso per le specie ittiche di acquacoltura, in particolare per l’intestino della tilapia. Gli enzimi di dissociazione efficaci variano a seconda del tipo di tessuto. Pertanto, è essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale selezionando l’enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. Questo studio illustra un protocollo ottimizzato per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall’intestino di tilapia del Nilo con una combinazione enzimatica di collagenasi/dispasi. Questa combinazione è altamente efficace per la dissociazione con l’utilizzo di albumina sierica bovina e DNasi per ridurre l’aggregazione cellulare dopo la digestione. La produzione cellulare soddisfa i requisiti per il sequenziamento di singole cellule, con una vitalità cellulare del 90% e un’alta concentrazione cellulare. Questo protocollo può anche essere modificato per preparare una sospensione unicellulare dall’intestino di altre specie di pesci. Questa ricerca fornisce un protocollo di riferimento efficiente e riduce la necessità di ulteriori prove nella preparazione di sospensioni monocellulari per specie ittiche di acquacoltura.
Introduction
Le cellule sono le unità fondamentali degli organismi. Rispetto agli studi sui tessuti di massa, gli studi a livello di singola cellula possono riflettere l’eterogeneità cellulare e fornire informazioni a risoluzione più elevata1. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno applicato tecnologie di sequenziamento a singola cellula per studi su genoma, trascrittoma, epigenoma o multi-omici a livello di singola cellula in mammiferi, zebrafish e altri organismi modello e hanno riportato grandi scoperte 2,3,4,5,6,7 . Mentre la maggior parte degli studi si è concentrata su organismi modello, ci sono pochi protocolli di riferimento o kit di dissociazione commerciale per il sequenziamento a singola cellula nelle specie ittiche economiche, il che limita l’applicazione del sequenziamento a singola cellula nella ricerca sull’acquacoltura. Pertanto, lo sviluppo di protocolli di dissociazione tissutale che producano sospensioni monocellulari di alta qualità con elevata vitalità cellulare e integrità dell’acido nucleico è fondamentale.
È essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale con l’enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. L’enzima più efficace per la dissociazione tissutale varia a seconda del tipo di tessuto. Nei mammiferi, diversi enzimi sono stati utilizzati per preparare sospensioni unicellulari per i tessuti solidi dei mammiferi, tra cui collagenasi, dispasi, tripsina, papaina, elastasi, ialuronidasi, liberase, accutasi e trypLE 8,9. La digestione della tripsina combinata con la rottura meccanica è stata comunemente usata per dissociare i tessuti per la coltura cellulare nei pesci 10,11,12,13,14. La tripsina è stata anche utilizzata o aggiunta nel cocktail di digestione per la dissociazione dei tessuti nell’intestino di ratto15 e nel tessuto branchiale zebrafish16. Tuttavia, per diversi motivi, la tripsina non è l’opzione migliore per il sequenziamento a singola cellula. La tripsina da sola è di solito inefficace per la dissociazione tissutale. Inoltre, la tripsina induce rotture del filamento di DNA 17,18 e degradazione dell’RNA19.
La papaina degrada le proteine che compongono le giunzioni strette tra le cellule. Nelle cellule nervose e muscolari lisce dei mammiferi, la papaina è più efficiente e meno distruttiva di altre proteasi20,21. Tuttavia, come la tripsina, la papaina provoca l’aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare che si verifica durante la digestione enzimatica9. L’elastasi rompe l’elastina, che si trova tipicamente nella pelle, nei polmoni, nei legamenti, nei tendini e nei tessuti vascolari22. È spesso usato in combinazione con collagenasi, dispasi o tripsina per dissociare il tessuto polmonare8. La ialuronidasi fende i legami glicosidici dello ialuronano, contribuendo alla digestione della matrice extracellulare in vari tessuti connettivi e della pelle 9,23.
In generale, la collagenasi e la dispasi sono buone opzioni per la rottura della matrice extracellulare. Sono stati utilizzati nella dissociazione degli intestini umani, di topo e zebrafish24,25,26,27. La collagenasi distrugge il legame peptidico nel collagene, promuove la digestione della matrice extracellulare e rilascia le cellule in sospensione e, quindi, la collagenasi viene spesso utilizzata per la dissociazione dei tessuti solidi umani e di topo, incluso il fegato 28,29, la milza30, il pancreas31 e l’intestino 25. La dispasi è una proteasi che idrolizza i legami peptidici N-terminali dei residui di amminoacidi non polari ed è più mite della collagenasi. Fende i componenti della matrice extracellulare, come la fibronectina, il collagene di tipo IV e, in misura minore, il collagene di tipo I, senza influenzare le giunzioni cellula-cellula. Dispase è usato separatamente o con altri enzimi per la dissociazione dei tessuti, come per intestino25,32, cervello33, fegato34, ecc. Inoltre, i cocktail di digestione disponibili in commercio, tra cui liberase, accutase e trypLE, sono anche buone alternative per la dissociazione dei tessuti solidi, in particolare per la pelle, il fegato e i reni 8,9.
La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) appartiene alla famiglia Cichlidae dell’ordine Perciformes. È una delle specie ittiche d’acqua dolce più coltivate nelle aree tropicali e subtropicali, con una produzione annua di 4,5 milioni di tonnellate nel 202235. È una delle specie di pesci di acquacoltura meglio studiate con un genoma ben annotato. La tilapia del Nilo è un modello di ricerca ideale per le specie ittiche di acquacoltura grazie al suo breve tempo di generazione, alla facilità di allevamento e all’adattabilità a una vasta gamma di ambienti di allevamento. L’intestino è di grande interesse di ricerca in quanto è l’organo della digestione e dell’assorbimento della nutrizione, del metabolismo e dell’immunità delle mucose. L’intestino è l’habitat delle popolazioni microbiche ed è un tessuto immunitario essenziale36. È immunologicamente attivo a causa della presenza di numerosi tipi di cellule immunitarie, tra cui macrofagi, cellule B, granulociti e cellule T.
Nel presente studio, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall’intestino della tilapia del Nilo per facilitare gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura. Secondo le caratteristiche di questi enzimi tessuto-specifici e il lavoro preliminare, la collagenasi/dispasi è appropriata per dissociare il tessuto intestinale della tilapia. L’ultimo tipo di enzima da considerare nella preparazione di sospensioni monocellulari è la DNasi-I, che impedisce l’aggregazione cellulare degradando il DNA libero rilasciato attraverso la lisi delle cellule morte durante la digestione enzimatica senza iniziare le vie apoptotiche9 e aumenta la resa delle cellule vive36. Inoltre, l’albumina sierica bovina (BSA) viene aggiunta al tampone di lavaggio per ridurre l’aggregazione cellulare e migliorare la vitalità cellulare. Diverse aziende produttrici di reagenti descrivono BSA come uno stabilizzatore enzimatico. L’aggiunta di BSA allo 0,04%-1% di BSA al PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) è stata utilizzata per sviluppare una soluzione di lavaggio per la preparazione di sospensioni di sequenziamento monocellulare senza effetti avversi38. L’aggiunta di un basso rapporto di BSA potrebbe aiutare a mantenere la vitalità cellulare ed evitare l’aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare. Questo protocollo può anche fornire un valido riferimento per lo sviluppo di protocolli di dissociazione cellulare dall’intestino di altre specie di pesci di acquacoltura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell’intestino di tilapia del Nilo. Prima della dissociazione, è necessaria la rimozione del grasso e del mesentere dall’intestino, in particolare per gli intestini di pesci carnivori con molto grasso. L’uso di una siringa invece di raschiare duramente per lavare via il contenuto intestinale riduce il danno meccanico alle cellule. Per garantire la vitalità cellulare, è anche essenziale mantenere la temperatura a 20 °C o inferi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) e del Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).
Materials
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
References
- Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
- He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
- Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
- Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
- Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
- Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
- Vrtačnik, P., Kos, &. #. 3. 5. 2. ;., Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn’s colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
- Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
- Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
- Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
- Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
- Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
- Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
- Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
- Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
- Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
- FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , (2022).
- Beck, B. H., Peatman, E. . Mucosal Health in Aquaculture. , (2015).
- Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
- Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
- Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
- Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
