ספרואידים של כבד אנושי מדם היקפי למחקרי מחלות כבד
Summary
כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.
Abstract
תאי כבד אנושיים יכולים ליצור מבנה תלת ממדי (3D) המסוגל לגדול בתרבית במשך כמה שבועות, תוך שמירה על יכולתם התפקודית. בשל טבעם להתקבץ בתרבית צלחות בעלות תכונות דבק נמוכות או ללא תכונות דבק, הם יוצרים צברים של תאי כבד מרובים הנקראים ספרואידים של כבד אנושי. היווצרותם של ספרואידים תלת-ממדיים בכבד מסתמכת על הנטייה הטבעית של תאי הכבד להצטבר בהיעדר מצע דביק. למבנים תלת-ממדיים אלה יש תגובות פיזיולוגיות טובות יותר מאשר לתאים, הקרובים יותר לסביבה in vivo . לשימוש בתרביות הפטוציטים תלת-ממדיות יש יתרונות רבים בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) קלאסיות, כולל מיקרו-סביבה רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית, מורפולוגיה אדריכלית המרכיבה מחדש איברים טבעיים, כמו גם חיזוי טוב יותר לגבי מצב המחלה ותגובות דמויות in vivo לתרופות. מקורות שונים יכולים לשמש ליצירת ספרואידים, כמו רקמת כבד ראשונית או קווי תאים אימורטליים. ניתן להנדס את רקמת הכבד התלת-ממדית גם באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) כדי להפיק הפטוציטים. השגנו ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) המופקים מדם היקפי ללא מניפולציה על ידי הפעלת חלבון הקשור לקרום אנושי הקשור ל- GPI ומובחן להפטוציטים אנושיים. תאי כבד אנושיים שמקורם ב-BD-PSCs וספרואידים של כבד אנושי נותחו במיקרוסקופ אור ואימונופנוטיפ באמצעות סמני כבד אנושיים.
Introduction
בשנים האחרונות מערכות תרבית ספרואידים תלת-ממדיות (3D) הפכו לכלי חשוב לחקר תחומים שונים של חקר סרטן, גילוי תרופות וטוקסיקולוגיה. תרביות כאלה מעוררות עניין רב משום שהן מגשרות על הפער בין חד-שכבות דו-ממדיות (2D) של תרביות תאים לבין איברים מורכבים1.
בהיעדר משטח דביק, בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית, היווצרות הספרואידים מבוססת על הזיקה הטבעית של תאים אלה להתקבץ בצורה תלת-ממדית. תאים אלה מתארגנים לקבוצות המורכבות מסוג אחד או יותר של תאים בוגרים. ללא חומרים זרים, תאים אלה מתקשרים זה עם זה כמו במיקרו-סביבה המקורית שלהם. התאים בתרבית תלת-ממדית קרובים הרבה יותר ובעלי אוריינטציה נכונה זה כלפי זה, עם ייצור מטריצה חוץ-תאית גבוה יותר מאשר תרביות דו-ממדיות, ומהווים סביבה טבעית קרובה 2.
מודלים של בעלי חיים שימשו במשך זמן רב לחקר ביולוגיה אנושית ומחלות3. בהקשר זה, ישנם הבדלים מהותיים בין בני אדם לבעלי חיים, מה שהופך מודלים אלה לא לגמרי מתאים למחקרים אקסטרפולטיביים. ספרואידים ואורגנואידים בתרבית תלת-ממדית מהווים כלי מבטיח לחקר ארכיטקטורה דמוית רקמה, אינטראקציה והצלבה בין סוגי תאים שונים המתרחשים in vivo ויכולים לתרום להפחתה או אפילו להחלפה של מודלים של בעלי חיים. הם מעניינים במיוחד לחקר הפתוגנזה של מחלות כבד, כמו גם פלטפורמות סינון תרופות4.
תרבית ספרואידים תלת-ממדית היא בעלת חשיבות מיוחדת לחקר הסרטן מכיוון שהיא יכולה לחסל את חוסר הרציפות בין התאים לסביבתם על ידי הפחתת הצורך בטריפסיניזציה או בטיפול בקולגנאז הדרוש להכנת חד-שכבות תאי הגידול לתרביות דו-ממדיות. ספרואידים סרטניים מאפשרים לחקור כיצד תאים נורמליים לעומת תאים ממאירים מקבלים ומגיבים לאותות מסביבתם5 והם חלק חשוב בלימודי ביולוגיה של גידולים.
בהשוואה לחד-שכבתיות, תרביות תלת-ממדיות המורכבות מסוגי תאים שונים דומות לרקמות הגידול בתכונותיהן המבניות והתפקודיות ולכן מתאימות לחקר גרורות ופלישה של תאי גידול. זו הסיבה שמודלים ספרואידים כאלה תורמים להאצת חקר הסרטן6.
ספרואידים גם עוזרים לפתח את הטכנולוגיה ליצירת אורגנואידים אנושיים מכיוון שביולוגיה של רקמות ואיברים מאתגרת מאוד למחקר, במיוחד בבני אדם. התקדמות בתרבית תאי גזע מאפשרת לפתח תרביות תלת ממדיות כמו אורגנואידים המורכבים מתאי גזע ואבות רקמות, כמו גם סוגים שונים של תאים בוגרים (רקמות) מאיבר עם כמה מאפיינים פונקציונליים כמו איבר אמיתי שניתן להשתמש בו כדי למדל התפתחות איברים, מחלות, אבל הם גם יכולים להיחשב שימושיים ברפואה רגנרטיבית7.
הפטוציטים אנושיים ראשוניים משמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה חוץ גופית של הפטוציטים אנושיים, תפקוד כבד ורעילות הנגרמת על ידי תרופות. לתרביות של הפטוציטים אנושיים יש שני חסרונות עיקריים, ראשית, הזמינות המוגבלת של רקמה ראשונית כמו הפטוציטים אנושיים, ושנית, הנטייה של הפטוציטים להתמיין במהירות בתרבית דו-ממדית ובכך לאבד את פונקציית הפטוציטים הספציפית שלהם8. תרביות כבד תלת-ממדיות הן טובות יותר בהקשר זה, ולאחרונה נוצרו מתאי גזע עובריים אנושיים ממוינים (hESCs) או מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs)9. ספרואידים תלת-ממדיים מהונדסים ביולוגית בכבד מעניינים במיוחד בחקר התפתחות, רעילות, מחלות גנטיות וזיהומיות של הכבד, כמו גם בגילוי תרופות לטיפול במחלות כבד10. לבסוף, יש להם גם פוטנציאל לשימוש קליני, בידיעה שלמחלות כבד חריפות יש שיעור תמותה של כמעט 80%, כבד ביו-מלאכותי ו / או ספרואידים בכבד יכולים להציל חולים אלה על ידי מתן תפקוד כבד חלקי עד שניתן למצוא תורם מתאים11.
קבענו פרוטוקול ליצירת ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) להכנת ספרואידים בגדלים שונים המכילים 4000 עד 1 x 106 תאים וניתחנו אותם באמצעות מיקרוסקופ אור ואימונופלואורסנציה. בדקנו גם את היכולת של תפקוד ספציפי לכבד, והערכנו את הביטוי של אנזימי ציטוכרום P450 3A4 (CYP3A4) ו-2E1 (CYP2E1) השייכים למשפחת הציטוכרום P450 שיש להם תפקידים חשובים במטבוליזם של תאים ותרופות באמצעות תהליך של ניקוי רעלים12.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכבד הוא איבר מרכזי בגוף האדם עם פונקציות ביולוגיות חיוניות רבות, כגון ניקוי רעלים של מטבוליטים. בשל אי ספיקת כבד חמורה כמו שחמת הכבד ו / או דלקת כבד ויראלית, ישנם כמעט 2 מיליון מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. השתלות כבד מדורגות במקום השני בהשתלות איברים מוצקים ברחבי העולם, אך רק כ-10% מהצורך הנוכח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה במיוחד על הסיוע הטכני שניתן על ידי אוקסנה וג’ון גרינאקר. עבודה זו נתמכה על ידי ACA CELL Biotech GmbH היידלברג, גרמניה.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease – A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
