Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen
Summary
Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.
Abstract
Menschliche Leberzellen können eine dreidimensionale (3D) Struktur bilden, die in der Lage ist, einige Wochen lang in Kultur zu wachsen und ihre Funktionsfähigkeit zu erhalten. Aufgrund ihrer Beschaffenheit, sich in den Kulturschalen mit geringen oder keinen Hafteigenschaften zu sammeln, bilden sie Aggregate mehrerer Leberzellen, die als menschliche Lebersphäroide bezeichnet werden. Die Bildung von 3D-Lebersphäroiden beruht auf der natürlichen Tendenz von Leberzellen, in Abwesenheit eines adhäsiven Substrats zu aggregieren. Diese 3D-Strukturen besitzen bessere physiologische Reaktionen als Zellen, die näher an einer In-vivo-Umgebung liegen. Die Verwendung von 3D-Hepatozytenkulturen hat im Vergleich zu klassischen zweidimensionalen (2D) Kulturen zahlreiche Vorteile, darunter eine biologisch relevantere Mikroumgebung, eine architektonische Morphologie, die natürliche Organe wieder zusammensetzt, sowie eine bessere Vorhersage des Krankheitszustands und der In-vivo-ähnlichen Reaktionen auf Medikamente. Verschiedene Quellen können verwendet werden, um Sphäroide zu erzeugen, wie primäres Lebergewebe oder immortalisierte Zelllinien. Das 3D-Lebergewebe kann auch unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) zur Ableitung von Hepatozyten hergestellt werden. Wir haben humane Lebersphäroide unter Verwendung von aus Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) gewonnen, die aus unmanipuliertem peripherem Blut durch Aktivierung von humanem membrangebundenem GPI-verknüpftem Protein erzeugt und zu menschlichen Hepatozyten differenziert wurden. Die von BD-PSCs abgeleiteten menschlichen Leberzellen und menschlichen Lebersphäroide wurden durch Lichtmikroskopie und Immunphänotypisierung unter Verwendung humaner Hepatozytenmarker analysiert.
Introduction
In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Sphäroidkultursysteme zu einem wichtigen Werkzeug entwickelt, um verschiedene Bereiche der Krebsforschung, Wirkstoffforschung und Toxikologie zu untersuchen. Solche Kulturen stoßen auf großes Interesse, da sie die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) Zellkultur-Monoschichten und komplexen Organen schließen1.
In Ermangelung einer adhäsiven Oberfläche beruht die Bildung von Sphäroiden im Vergleich zur 2D-Zellkultur auf der natürlichen Affinität dieser Zellen zu Clustern in 3D-Form. Diese Zellen organisieren sich in Gruppen, die aus einer oder mehreren Arten reifer Zellen bestehen. Frei von Fremdstoffen interagieren diese Zellen miteinander wie in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung. Die Zellen in der 3D-Kultur sind viel näher beieinander und haben eine richtige Ausrichtung zueinander, mit einer höheren extrazellulären Matrixproduktion als 2D-Kulturen, und bilden eine nahe an der natürlichen Umgebung 2.
Tiermodelle werden seit langem verwendet, um die menschliche Biologie und Krankheiten zu untersuchen3. In dieser Hinsicht gibt es intrinsische Unterschiede zwischen Mensch und Tier, was diese Modelle für extrapolative Studien nicht vollständig geeignet macht. 3D-Kultursphäroide und -Organoide stellen ein vielversprechendes Werkzeug dar, um gewebeähnliche Architektur, Interaktion und Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, die in vivo auftreten, und können dazu beitragen, Tiermodelle zu reduzieren oder sogar zu ersetzen. Sie sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Pathogenese von Lebererkrankungen sowie für Wirkstoff-Screening-Plattformen4.
Die 3D-Sphäroidkultur ist für die Krebsforschung von besonderer Bedeutung, da sie die Diskontinuität zwischen den Zellen und ihrer Umgebung beseitigen kann, indem sie den Bedarf an Trypsinisierung oder Kollagenasebehandlung reduziert, der für die Vorbereitung der Tumorzellmonoschichten für 2D-Kulturen erforderlich ist. Tumorsphäroide ermöglichen die Untersuchung, wie normale und bösartige Zellen Signale aus ihrer Umgebung empfangen und darauf reagieren5 und sind ein wichtiger Bestandteil tumorbiologischer Studien.
Im Vergleich zur Monoschicht ähneln 3D-Kulturen, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen, in ihren strukturellen und funktionellen Eigenschaften Tumorgeweben und eignen sich daher für die Untersuchung von Metastasen und Invasionen von Tumorzellen. Deshalb tragen solche Sphäroidmodelle dazu bei, die Krebsforschung zu beschleunigen6.
Sphäroide tragen auch dazu bei, die Technologie zur Herstellung menschlicher Organoide zu entwickeln, da die Gewebe- und Organbiologie insbesondere beim Menschen sehr schwierig zu untersuchen ist. Fortschritte in der Stammzellkultur ermöglichen die Entwicklung von 3D-Kulturen wie Organoiden, die aus Stammzellen und Gewebevorläufern bestehen, sowie verschiedene Arten von reifen (Gewebe-)Zellen aus einem Organ mit einigen funktionellen Eigenschaften wie einem echten Organ, das zur Modellierung der Organentwicklung und von Krankheiten verwendet werden kann, aber auch in der regenerativen Medizin als nützlich angesehen werdenkann 7.
Primäre menschliche Hepatozyten werden normalerweise für die Untersuchung der In-vitro-Biologie menschlicher Hepatozyten, der Leberfunktion und der arzneimittelinduzierten Toxizität verwendet. Kulturen menschlicher Hepatozyten haben zwei Hauptnachteile, erstens die begrenzte Verfügbarkeit von primärem Gewebe wie menschlichen Hepatozyten und zweitens die Tendenz von Hepatozyten, sich in 2D-Kulturen schnell zu dedifferenzieren, wodurch ihre spezifische Hepatozytenfunktion verlorengeht 8. 3D-Leberkulturen sind in dieser Hinsicht überlegen und wurden kürzlich aus differenzierten humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) hergestellt9. Biotechnologisch hergestellte hepatische 3D-Sphäroide sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Entwicklung, Toxizität, genetischen und infektiösen Erkrankungen der Leber sowie für die Wirkstoffforschung zur Behandlung von Lebererkrankungen10. Schließlich haben sie auch das Potenzial, klinisch eingesetzt zu werden, da sie wissen, dass akute Lebererkrankungen eine Sterblichkeitsrate von fast 80 % aufweisen, biokünstliche Leber- und/oder Lebersphäroide diese Patienten möglicherweise retten könnten, indem sie eine partielle Leberfunktion bereitstellen, bis ein geeigneter Spender gefunden werden kann11.
Wir haben ein Protokoll für die Erzeugung von humanen hepatischen Sphäroiden unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen aus Blut (BD-PSCs) zur Herstellung unterschiedlich großer Sphäroide mit 4000 bis 1 x 106 Zellen erstellt und mittels Lichtmikroskopie und Immunfluoreszenz analysiert. Wir testeten auch die Fähigkeit der Hepatozyten-spezifischen Funktion und bewerteten die Expression von Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) und 2E1 (CYP2E1) Enzymen, die zur Cytochrom-P450-Familie gehören und eine wichtige Rolle im Zell- und Arzneimittelstoffwechsel während des Entgiftungsprozesses spielen12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Leber ist ein wichtiges Organ im menschlichen Körper mit vielen wesentlichen biologischen Funktionen, wie z.B. der Entgiftung von Metaboliten. Aufgrund schwerer Leberversagen wie Leberzirrhose und/oder Virushepatitis gibt es weltweit fast 2 Millionen Todesfälle pro Jahr. Lebertransplantationen stehen weltweit an zweiter Stelle bei Transplantationen solider Organe, aber nur etwa 10% des derzeitigen Bedarfs werden gedeckt22.
Primäre humane Hepatozyten (PHH) werden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind besonders dankbar für die technische Unterstützung von Oksana und John Greenacre. Diese Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH, Heidelberg, unterstützt.
Materials
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
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