In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

Summary

In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.

Abstract

Het proces van myelinisatie is essentieel om een snelle en voldoende signaaltransductie in het zenuwstelsel mogelijk te maken. In het perifere zenuwstelsel gaan neuronen en Schwann-cellen een complexe interactie aan om de myelinisatie van axonen te beheersen. Verstoringen van deze interactie en afbraak van de myelineschede zijn kenmerken van inflammatoire neuropathieën en komen secundair voor bij neurodegeneratieve aandoeningen. Hier presenteren we een cocultuurmodel van dorsale wortelganglionexplantaten en Schwann-cellen, dat een robuuste myelinisatie van perifere axonen ontwikkelt om het proces van myelinisatie in het perifere zenuwstelsel te onderzoeken, axon-Schwann-celinteracties te bestuderen en de potentiële effecten van therapeutische middelen op elk celtype afzonderlijk te evalueren. Methodologisch werden dorsale wortelganglions van embryonale ratten (E13.5) geoogst, gedissocieerd van hun omringende weefsel en gedurende 3 dagen als volledige explantaten gekweekt. Schwann-cellen werden geïsoleerd van 3 weken oude volwassen ratten en ischiaszenuwen werden enzymatisch verteerd. De resulterende Schwann-cellen werden gezuiverd door magnetisch geactiveerde celsortering en gekweekt onder neureguline- en forskoline-verrijkte omstandigheden. Na 3 dagen dorsale wortel ganglion explantatiecultuur werden 30.000 Schwann-cellen toegevoegd aan één dorsale wortelganglionexplant in een medium dat ascorbinezuur bevat. De eerste tekenen van myelinisatie werden gedetecteerd op dag 10 van cocultuur, door verspreide signalen voor myeline basisch eiwit in immunocytochemische kleuring. Vanaf dag 14 werden myelineschedes gevormd en verspreid langs de axonen. Myelinisatie kan worden gekwantificeerd door myeline basiseiwitkleuring als een verhouding van het myelinisatiegebied en het axongebied, om rekening te houden met de verschillen in axonale dichtheid. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om verschillende aspecten van perifere myelinisatie in vitro te bestuderen, wat cruciaal is voor het begrijpen van de pathologie van en mogelijke behandelingsmogelijkheden voor demyelinisatie en neurodegeneratie bij inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten van het perifere zenuwstelsel.

Introduction

In het perifere zenuwstelsel (PNS) wordt snelle informatietransductie gemedieerd door met myeline omwikkelde axonen. De myelinisatie van axonen is essentieel om de snelle voortplanting van elektrische impulsen mogelijk te maken, omdat de geleidingssnelheid van de zenuwvezels correleert met de axondiameter en myelinedikte¹. Sensorische signalering van de periferie naar het centrale zenuwstelsel (CZS) is afhankelijk van de activering van sensorische neuronen van de eerste orde die zich bevinden in vergrotingen van de dorsale wortel, genaamd dorsale wortelganglia (DRG). Voor de vorming en het onderhoud van myeline is continue communicatie tussen axonen en Schwann-cellen, de myeliniserende Glia-cellen in de PNS, verplicht².

Veel ziekten van de PNS verstoren de transductie van informatie door primaire axonale of demyeliniserende schade, wat resulteert in hypesthesie of dysesthesie. Sensorische neuronen van de eerste orde hebben het vermogen om tot op zekere hoogte te regenereren na neuronale schade, door een complexe interactie tussen het neuron en de omliggende Schwann-cellen³. In dit geval kunnen Schwann-cellen cellulaire herprogrammering ondergaan om zowel axonaal als myeline-puin te verwijderen en axonale regeneratie te bevorderen, wat resulteert in remyelinisatie⁴. Het begrijpen van de mechanismen van myelinisatie in gezondheid en ziekte is belangrijk om mogelijke behandelingsopties te vinden voor demyeliniserende aandoeningen van de PNS. Myeline kan ook worden beschadigd door acuut neurotrauma en benaderingen om myelinisatie te bevorderen om functioneel herstel na perifeer zenuwletsel te bevorderen, worden onderzocht⁵.

Onze kennis van perifere myelinisatie heeft grotendeels geprofiteerd van myeliniserende coculturen van Schwann-cellen en sensorische neuronen. Sinds de eerste benaderingen werden toegepast ^6,7,8, is myelinisatie intensief bestudeerd met behulp van verschillende cocultuursystemen^9,10,11. Hier bieden we een snel en gemakkelijk protocol voor robuuste in vitro myelinisatie van dorsale wortelganglion axonen. Het protocol voor Schwann-celpreparatie is gebaseerd op het protocol van Andersen et al.12, eerder gepubliceerd in Pitarokoili et ^al.13. We gebruiken Schwann-cellen afkomstig van juveniele ratten en embryonale DRG-explantculturen voor de cocultuur, waarbij myelinisatie optreedt rond dag 14. Het doel van de methode is om een systeem te bieden om de vorming van myeline als gevolg van directe axon-Schwann-celinteractie te onderzoeken en om modulatoren van PNS-myelinisatie te bestuderen. In vergelijking met gedissocieerde neuronale celculturen zijn DRG-explantaten anatomisch meer bewaard gebleven en vormen ze lange axonale processen. Kwantificering van het gemyeliniseerde axongebied biedt een voldoende uitlezing voor myelinisatie in de cocultuur. De methode is een waardevol hulpmiddel om therapeutische verbindingen te screenen op hun potentiële effect op PNS-myelinisatie en kan ook worden gebruikt naast in vivo studies in diermodellen¹⁴.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. 1. Schwann celkweek Coating voor Schwann celkweekBedek de celkweekschalen onder steriele omstandigheden. Breng 2 ml 0,01% poly-L-lysine (PLL) aan op twee weefselkweekschalen (TC) van 60 mm en incubeer een nacht bij 4 °C. Verwijder de PLL, was de TC-vaat 2x met gedestilleerd water en inc…

Representative Results

Myelinisatie in de cocultuur werd beoordeeld op dag 10, 12, 14, 16, 18 en 20. De DRG-explantaten en Schwann-cellen werden gekleurd voor MBP, βIII-tubuline en DAPI. Het axonale netwerk in de cocultuur was dicht en veranderde niet zichtbaar in het tijdsverloop van de waarneming. De eerste tekenen van myeline, in de vorm van kleine fragmenten, waren detecteerbaar op dag 10 en namen toe op dag 12 (figuur 2). De MBP-positieve gebieden namen in de loop van de tijd toe tot dag 20 van cultuur. De m…

Discussion

Hier presenteren we een snel en gemakkelijk protocol voor het genereren van in vitro myelinisatie door twee afzonderlijke celtypeculturen, Schwann-cellen en dorsale wortelganglionexplantaten, samen te voegen.

Een cruciale stap van het protocol is de teelt van DRG-explantaten, vooral in de eerste dagen van de teelt. DRG zijn zeer kwetsbaar voordat een sterk axonaal netwerk wordt gebouwd en moeten zeer voorzichtig worden behandeld, bijvoorbeeld wanneer ze uit de incubator worden gehaald…

Materials

Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285