Summary
Her beskriver vi en protokoll for transplantasjon og sporing av merkede nevrale celler i humane cerebrale organoider.
Abstract
Fremdriften av celletransplantasjonsmetoder krever modellsystemer som tillater en nøyaktig vurdering av transplantert cellefunksjonell styrke. For sentralnervesystemet, selv om xenotransplantasjon fortsatt er state-of-the-art, er slike modeller teknisk utfordrende, begrenset i gjennomstrømning og dyre. Videre kryssreagerer ikke miljøsignalene som er tilstede, perfekt med menneskelige celler. Dette papiret presenterer en billig, tilgjengelig og høy gjennomstrømningskompatibel modell for transplantasjon og sporing av humane nevrale celler i humane cerebrale organoider. Disse organoider kan lett genereres fra humane induserte pluripotente stamceller ved hjelp av kommersielle kits og inneholder nøkkelcelletyper av storhjernen.
Vi demonstrerer først denne transplantasjonsprotokollen med injeksjon av EGFP-merkede humane iPSC-avledede nevrale stamceller (NPC) i disse organoider. Vi diskuterer deretter hensyn for å spore veksten av disse cellene i organoid ved levende cellefluorescensmikroskopi og demonstrere sporing av transplanterte EGFP-merkede NPCer i en organoid over en 4 måneders periode. Til slutt presenterer vi en protokoll for snitting, syklisk immunfluorescerende farging og avbildning av de transplanterte cellene i deres lokale kontekst. Den organoidtransplantasjonsmodellen som presenteres her, tillater langsiktig (minst 4 måneder) sporing av transplanterte humane celler direkte i et humant mikromiljø med en billig og enkel å utføre protokoll. Det representerer dermed en nyttig modell både for nevrale celleterapier (transplantasjoner) og sannsynligvis for modellering av sentralnervesystemet (CNS) svulster på en mer mikromiljømessig nøyaktig måte.
Introduction
Den menneskelige hjerne er et komplekst organ sammensatt av flere celletyper av nevrale og gliallinjer. Sammen danner disse et sofistikert nettverk som gir opphav til kognisjon. Det er betydelig interesse for transplantasjon av celler i dette systemet som behandling for et bredt spekter av nevrologiske lidelser, inkludert traumatisk hjerneskade (TBI) 1,2, neurodegenerative lidelser 3,4,5,6,7 og hjerneslag8. En stor begrensning i utviklingen av slike strategier er imidlertid den relative mangelen på tilgjengelige prekliniske modeller for å bestemme de forventede transplantasjonsresultatene. De mest brukte modellene for tiden er in vitro-dyrkningsmetoder for å bestemme cellepotensial og xenotransplantasjon i mus. Mens cellekulturmetoder kan vurdere differensiering og selvfornyelsespotensial9, utføres disse under optimale vekstforhold som ikke etterligner mikromiljøet cellene ville møte i en transplantasjonskontekst. Videre kan måten cellene dyrkes på påvirke deres oppførsel10.
Musehjerner inneholder alle cellene i mikromiljøet og er dermed ekstremt kraftige modellsystemer for transplantasjon11. Det er imidlertid viktige forskjeller mellom mus og menneskelig cortex12,13, og ikke alle vekstfaktorer kryssreagerer mellom arter. Primatmodeller er et nærmere alternativ som bedre etterligner det menneskelige systemet og har også gitt viktige prekliniske resultater14. Selv disse nærmere beslektede slektningene beholder imidlertid viktige forskjeller i deres cellulære sminke15. Mens begge disse modellsystemene gir verdifull innsikt i celleadferd under transplantasjon og innlemmer de kirurgiske elementene i en eventuell terapi, forblir de ufullkomne. De er også kostbare og teknisk utfordrende (dvs. man må utføre hjernekirurgi på dyrene), og begrenser dermed den mulige gjennomstrømningen. Videre er det en mengde etiske problemstillinger knyttet til transplantasjon av menneskelige hjerneceller til dyr16. Hjerneskivekulturer tillater at en hjerne kuttes og brukes til flere behandlinger, og dermed fjerner noen av begrensningene ved dyretransplantasjoner; Imidlertid har disse begrenset levetid (uker), er fortsatt dyreavledet, og (som en tynn skive) har ikke tilstrekkelig volum / overflateintegritet til å etterligne injeksjon av celler17. Dermed er det fortsatt et viktig gap mellom strengt cellekultur / potensielle modeller og in vivo transplantasjon.
Cerebrale organoider er en in vitro-modell som inneholder de viktigste nevrale celletypene som er tilstede i hjernen, og kan genereres i høyt antall fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs)18,19. Slike organoider gir dermed en cellulær kontekst, noe som kan tillate vurdering av funksjonskapasiteten til en testcelle av interesse i transplantasjonsinnstillingen. Faktisk viste en nylig studie at nevrale stamceller (NPCer) transplantert i humane cerebrale organoider overlever, sprer seg og skiller seg på samme måte som NPCer transplantert inn i hjernen til en npå-overvektig diabetiker severe kombinert immundefekt gamma (NSG) mus20. Cerebrale organoider representerer dermed et grusomhetsfritt, langvarig (>6 måneder), kostnadseffektivt system som fanger celletypene i den menneskelige hjerne. Som sådan kan de representere en ideell transplantasjonsmottaker for tidlig testing av nevrale cellers regenerative kapasitet.
Denne artikkelen presenterer en protokoll for transplantasjon og påfølgende sporing av merkede humane NPCer i humane cerebrale organoider (figur 1). Dette begynner med injeksjon av GFP-merkede NPCer i modne (2-4 måneder gamle) cerebrale organoider18. De transplanterte cellene blir deretter etterfulgt av levende cellefluorescensmikroskopi over en 4 måneders periode. I løpet av denne tiden viser vi både persistensen av celler på injeksjonsstedet, men også migrasjon til distale regioner av organoiden. På sluttpunktet demonstrerer vi antigengjenfinning, farging og avbildning av histologiske seksjoner avledet fra disse organoidene, inkludert en protokoll for slukking av eksisterende AlexaFluor-baserte fargestoffer for å tillate ytterligere farging og avbildningsrunder, basert på tidligere arbeid21. Denne protokollen kan derfor være nyttig ved måling av differensieringskapasiteten til celler i en transplantasjonsinnstilling, transplantatvarighet, celleutvidelse in situ og cellemigrasjon fra transplantasjonsstedet. Vi forventer at dette vil være nyttig både for regenerativ medisin / celleterapiapplikasjoner, samt tumormodellering ved å innpode tumorceller i relevante regionspesifikke organoider.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Fluoroformerking av celler ved lentiviral transduksjon
- Tine en alikot av den solubiliserte kjellermembranmatrisen du velger på is.
- Mens alikoten tiner, tilsett sterilt vann for å fylle hullene mellom brønnene i en 24-brønnsplate, sammen med alle de ytre brønnene.
MERK: Dette etterlater åtte brønner åpne i midten for bruk og sikrer at cellene forblir i høy luftfuktighet, og minimerer dermed fordampningsindusert variabilitet. - Fortynn den løselige kjellermembranmatrisen 1:100 i iskaldt DMEM / F12-medium (en endelig konsentrasjon på 0,089 mg / ml ble oppnådd med partiet som ble brukt her).
- Tilsett 300 μL av den fortynnede løselige kjellermembranmatrisen til en av de midterste (åpne) brønnene i den tilberedte 24-brønnplaten per infeksjon som skal utføres. Sørg for å jevnt dekke hele bunnen av brønnen, og legg til mer, om nødvendig, for å sikre et jevnt belegg.
- Inkuber platen i 30 min ved 37 °C slik at et lag kan størkne langs brønnbunnen. Kontroller på slutten av denne inkubasjonen at væsken fortsatt dekker brønnbunnen fullt ut og ikke har fordampet i midten. Fordampning er et tegn på at fuktigheten er for lav; Hvis dette skjer, gjenta belegget.
MERK: Platene kan belegges kvelden før og etterlates i fortynnet løselig kjellermembranmatrise uten tydelige dårlige effekter; Imidlertid øker risikoen for fordampning kraftig, så de må inspiseres nøye før bruk. - Fjern mediet fra en brønn med konfluente iPSC-avledede NPC-er som vokser i en brønnplate.
MERK: For dette papiret ble iPSC-avledede nevrale progenitorer produsert ved hjelp av et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner mellom passasje 3 og passasje 10 brukt. - Tilsett forsiktig 1 ml PBS på siden av brønnen, og vend platen for å sikre jevn vask.
- Fjern PBS, og erstatt med 300 μL av den proteolytisk-kollagenolytiske enzymblandingen, og gyng platen igjen for å sikre å belegge brønnbunnen helt. Inkuber i 5 minutter ved 37 °C. Kontroller at cellene løsner fra plateoverflaten ved lysmikroskopi.
- Med en P1,000-pipette, tilsett 700 μL DMEM / F12, og løsne cellene ved å sprøyte denne blandingen over alle overflatene på bunnen av platen. Pipett opp og ned for å sikre at celleaggregatene brytes opp til en jevn encellesuspensjon. Ta opp cellene, og legg til 9 ml DMEM / F12 medium i et konisk 15 ml rør.
- Sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter.
- I løpet av denne tiden må du klargjøre nok medium supplert med 10 μM Y-27632 til at 500 μL per brønn kan belagt, pluss 1 ml til resuspensjon.
MERK: Y-27632 er nødvendig for å sikre høy overlevelse av NPCene etter passering som enkeltceller. - Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml Y-27632-supplert medium, pipetter forsiktig opp og ned flere ganger for å bryte opp celleaggregatene.
- Ta ut noen mikroliter celler, og fortynn dem (1:5 til 1:10) i trypanblått.
- Telle levedyktige (trypan blå-negative) celler på et hemocytometer. Juster trypanblå fortynning for å få minst 50 levedyktige celler per kvadrant av hemocytometeret for å sikre at tellingene er nøyaktige. Beregn volumet av cellesuspensjon som trengs for at 100 000 celler skal være til stede i hver brønn.
- Bland cellene forsiktig opp og ned ved pipettering, og ta opp det beregnede volumet (for 100 000 celler per brønn). Legg dette til det Y-27632-supplerte mediet (fra trinn 1.11) slik at det endelige volumet er 500 μL per brønn som skal belagt.
- Fjern den fortynnede løselige kjellermembranmatrisen fra de tidligere belagte brønnene (forutsatt at 30 min eller lengre inkubasjon er fullført).
- Bland cellene forsiktig ved pipettering, og tilsett 500 μL av cellesuspensjonen til hver brønn.
- For å fordele cellene jevnt, flytt platen i en stor "+" tegnbevegelse med milde lineære feier (fremover-bakover, stopp, bak-frem) umiddelbart før du plasserer den i en cellekulturinkubator.
- Inkuber over natten (16-24 timer) ved 37 °C og 5% CO2.
- Fjern mediet, og tilsett titrert lentivirus. Hvis enkeltintegrasjonshendelser kreves, sikt på en infeksjonsmengde på 0,3 smittsomme enheter per celle (ideelt titrert på cellene av interesse), og fyll opp til 500 μL i medium (uten Y-27632).
MERK: Den lentivirus av interesse kan kjøpes pre-titrert eller produsert internt som gjort tidligere22. Her ble et egenprodusert GFP lentivirus med puromycinresistens brukt til å generere og velge NPC-ene som uttrykker EGFP. Hvis lentiviruset ikke er titrert på cellene av interesse og kopinummeret er kritisk, anbefales det at flere volumer legges til et par brønner og at brønnen med ~30% EGFP + celler 48-72 timer brukes senere. Hvis kopinummeret ikke er kritisk, kan overflødig virus legges til med forbehold om at innsettingsmutagenese kan føre til uregelmessig oppførsel hos noen kloner. FORSIKTIG: Lentivirale vektorer er en biologisk fare på nivå 2-3 (avhengig av innholdet). Følg lokale biosikkerhetsforskrifter for håndtering av lentivirus, dekontaminering av overflater og plastvarer og flytende avfall. - Returner cellene til inkubatoren, og inkuber dem i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjern cellene fra inkubatoren, og fjern supernatanten.
FORSIKTIG: Siden supernatanten fra cellene fortsatt inneholder lentivirale partikler på dette tidspunktet, fortsett å følge lokale biosikkerhetsforskrifter for håndtering og destruksjon. - Skyll cellene med 2 x 500 μL PBS ved forsiktig å legge PBS til veggen av brønnen; Fjern deretter fra brønnhjørnet for å vaske bort gjenværende lentivirus.
FORSIKTIG: Siden supernatanten fra cellene fortsatt inneholder lentivirale partikler på dette tidspunktet, fortsett å følge lokale biosikkerhetsforskrifter for håndtering og destruksjon. - Bytt til 500 μl ferskt medium (uten Y-27632), og fortsett å vokse ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.
- Bruk levende cellefluorescensmikroskopi for å verifisere andelen celler som uttrykker EGFP og velg brønnen for å fortsette.
- Hvis den valgte lentivirale vektoren inneholder en seleksjonskassett (antibiotikaresistensgen som puromycinresistens), tilsett seleksjonsmidlet (her 1 μg/ml puromycin) til mediet ved en tidligere validert dose som dreper sensitive, men ikke resistente celler. Ellers bruker du fluorescensaktivert cellesortering for å isolere EGFP + -cellene på tidspunktet for den første splittelsen.
- Fra nå av vedlikeholder du cellene med daglig overvåking for konfluens, og utfører fullstendige middels endringer daglig.
- Når samløpet er nådd, klargjør du en eller flere brønner på en fersk 6-brønns belagt plate (med 1 ml fortynnet løselig kjellermembranmatrise, se trinn 1.3-1.5), og høst cellene som beskrevet i trinn 1.6-1.15.
MERK: Hvis ingen seleksjonsmiddel er inkludert, sorter cellene etter flowcytometri på dette stadiet. Sørg for at cellene sorteres med en tilstrekkelig bred dyse og lavt trykk for å minimere stress, samt at 10 μM Y-27632 er inkludert i hvert trinn i sorteringsprosessen. - Plate cellene til en endelig tetthet på 200 000 celler / cm2.
- Oppretthold den daglige overvåkingen og fullfør middels endringer daglig.
MERK: Når cellene igjen når samløp, er de nå klare til bruk. Alternativt kan et lager nå fryses ned for fremtidig bruk som følger. - Del opp, høst og tell cellene som beskrevet i trinn 1.6-1.15.
- Forhåndsmerk et sett med kryovialer med relevant informasjon (f.eks. passasje, EGFP%, linje).
- Resuspendere ved 400 000 celler/ml i medium + 10% DMSO.
MERK: DMSO er giftig for celler når den ikke er frossen, så minimer tiden brukt ved romtemperatur i nærvær av DMSO. - Tilsett 1 ml (400 000 celler) av blandingen fra trinn 1,33 per kryovial, og sett i en cellefrysebeholder.
- Overfør beholderen til en fryser på −80 °C over natten.
- Neste dag, overfør cellene til flytende nitrogen for langtidslagring.
2. Merket celleinjeksjon i hjerneorganoiden
MERK: For dette papiret ble cerebrale organoider produsert ved hjelp av et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner. Dette kan erstattes med cerebral organoid av interesse. Materialene som brukes i denne delen av protokollen må forkjøles for å unngå gelering av den løselige kjellermembranmatrisen ved over 4 °C.
- Plasser insulinsprøyten(e), spissene og rørene som skal være i kontakt med den oppløselige kjellermembranmatrisen ved -20 °C for å la dem avkjøles.
- Tine en passende størrelse alikot av løselig kjellermembranmatrise på is, avhengig av antall injeksjoner som skal utføres (~ 2 μL / injeksjon). Dette tar ca. 30 min.
- Mens alikoten tiner, deles, høstes og teller cellene som beskrevet i trinn 1.6-1.15.
- Beregn nødvendig volum per injeksjon. Hvis du gjør flere injeksjoner, plasser det totale volumet av celler i et 1,5 ml rør, og legg opp til 1 ml DMEM / F12.
MERK: Et volum som tillater noen ekstra injeksjoner, bør brukes til å ta hensyn til tap/pipetteringsfeil. - Plasser cellene i is mens de neste trinnene forberedes.
- Etter tining, fortynn den løselige kjellermembranmatrisen til en endelig konsentrasjon på 3 mg / ml i iskald DMEM / F12.
- Ta encellesuspensjonen fra isen, og spinn den ned ved 300 × g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: Hvis en nedkjølt sentrifuge ikke er tilgjengelig, ser spinning ved romtemperatur generelt ut til å tolereres. - Fjern mediet forsiktig helt uten å forstyrre cellepelleten. Resuspender cellepelleten med forsiktig pipettering i den fortynnede, oppløselige membranmatriksen i kjelleren (3 mg/ml) for å oppnå et endelig volum på 2 μL per injeksjon som skal utføres, og legg den umiddelbart tilbake på is til bruk.
MERK: Resuspenderingen av cellene må utføres sakte og med forkjølte spisser for å unngå dannelse av bobler og gelering. - Overfør den eller de forkjølte sprøytene fra fryseren på −20 °C til en isbøtte. Oppbevar dem der til bruk.
- Fjern platen med hjerneorganoider fra inkubatoren. Bruk en spiss med bred boring for å overføre organoiden som skal injiseres i en 35 mm tallerken. Fjern alt mediet som er mulig uten å skade organoiden for å stabilisere den og lette injeksjonen.
MERK: Det er viktig å bruke brede borespisser for å unngå å ødelegge organoiden. Hvis de ikke er tilgjengelige, klipp enden av en vanlig P1,000-spiss med steril saks. - Plasser 35 mm-fatet som inneholder organoiden under et dissekerende mikroskop for å veilede og lette injeksjonen.
MERK: Hvis et dissekerende mikroskop ikke er tilgjengelig i et sterilt område, er det mulig å utføre injeksjonen uten en, om enn med noe redusert kontroll. Et annet alternativ er bruk av en forstørrelsessløyfe eller briller. - Når organoiden(e) er klar til å injiseres, resuspenderes cellene forsiktig med en avkjølt P20-pipettespiss og flytter 2 μL (som inneholder ønsket antall celler som skal injiseres) på et forkjølt sterilt glassglass.
MERK: For flere injeksjoner kan ytterligere 2 μL volum legges over glassglasset. Hold den på is, og pass på å unngå fordampning. - Ta en forkjølt insulinsprøyte fra isen, og trekk sakte opp de 2 μl cellesuspensjonen med skråkanten av nålen vendt ned slik at alle cellene/mediet kan tas opp.
MERK: Sørg for å gå ekstremt sakte for å unngå å trekke inn luft. - Åpne lokket på fatet som inneholder organoiden, og fokuser mikroskopet på det. Hold fatet med en hånd. Plasser skråningen av nålen opp, og med den andre hånden, injiser cellene sakte inn i organoidoverflaten.
MERK: Det er viktig å injisere langsomt for å unngå å skade vevet. - Etter injeksjonen, legg lokket tilbake i fatet, og la den injiserte organoiden sitte i 1-2 min.
MERK: Dette gjør at den fortynnede løselige kjellermembranmatrisen kan gelere, og holde cellene på plass. Hvis mediet tilsettes for tidlig, kan det vaske bort cellene som sitter på overflaten. - Tilsett forsiktig 500 μL av organoidmediet, og overfør organoidet med en bred borespiss til en brønn med en 24-brønnsplate. Inkuber organoiden ved 37 °C og 5 %CO2 over natten. Utfør komplette middels endringer annenhver dag.
MERK: Det er viktig å inkludere en negativ kontrollorganoid (mock injisert), som vil bli brukt til bildejusteringer. For å gjøre dette, injiser en organoid som tidligere beskrevet med fortynnet løselig kjellermembranmatrise (3 mg / ml) for å oppnå et endelig volum på 2 μL uten celler.
3. Graftsporing ved levende cellefluorescensavbildning
MERK: Bruk et fluorescensmikroskop som kan opphisse fluoroforen av interesse og har filtersettet som trengs for å oppdage fluorescens. Som nevnt tidligere var NPC-ene som ble brukt her EGFP +, med en eksitasjonstopp på 488 nm og en utslippstopp på ~ 510 nm.
- Legg inn en negativ kontrollorganoid (ikke-injisert eller mock injisert), og still belysningsintensiteten og eksponeringstiden slik at autofluorescens er minimal. For instrumentet som ble brukt her, ble belysningsintensiteten satt mellom 1 og 2 og eksponeringstiden mellom 80 ms og 100 ms.
MERK: Siden mange eksitasjonsbølgelengder (spesielt lavere bølgelengder) kan være giftige for celler, anbefales det å holde intensiteten lav og unngå å lete for lenge for å forhindre skade på organoiden. - Legg i den positive kontrollorganoiden, og øk eksponeringstiden om nødvendig for å sikre at merkede celler er godt synlige. Flytt organoiden med en pipettespiss med bred boring for å finne injeksjonsstedet (EGFP+ -regionen).
- Fjern mediet helt fra den negative kontrollorganoiden. Legg inn den negative kontrollorganoiden, og avbilde den med de valgte innstillingene (for instrumentet som ble brukt her, ble belysningsintensiteten satt mellom 1 og 2 og eksponeringstiden mellom 80 ms og 100 ms). Når avbildningen er fullført, tilsett umiddelbart nytt medium for å forhindre at organoiden tørker ut.
MERK: Middels fjerning er avgjørende for å få et godt bilde, da det fikser høyden og orienteringen til organoidene, som ellers flyter og beveger seg konstant, og utelukker bilder av høy kvalitet. - Gjenta mediefjerningen / avbildningen med hver av testorganoidene.
- Returner organoidene til normale inkubasjons-/mediumforandringer (som i trinn 2.16), og gjenta avbildningen med ønskede intervaller. Her ble organoidene avbildet i uke 1, uke 9 og uke 16 etter injeksjon for å følge og teste overlevelse, spredning, differensiering og migrasjon av de injiserte EGFP + NPC-ene.
4. Histologi og immunfluorescens
- På endepunktet overfører du organoiden til en histologikassett merket med organoidens ID og andre nødvendige identifikatorer.
- Fyll kassetten med 10% formalin, og lukk den. Oppbevares i romtemperatur i 24 timer.
- Overfør den lukkede kassetten med organoid til en vevsprosess, og sett følgende protokoll: etanol 70% 10 min, etanol 80% 20 min, etanol 95% 30 min, etanol 100% 30 min, etanol 100% 40 min, etanol 100% 50 min, toluen 30 min, toluen 40 min, toluen 50 min, parafin 25 min ved 59 °C, parafin 35 min ved 59 °C, parafin 40 min ved 59 °C, parafin 50 min ved 59 °C.
MERK: Trinnene ovenfor utføres under vakuum ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert. Denne protokollen erstatter vannet med gradienter av alkohol opp til 100%. Det mellomliggende trinnet med toluen er en overgang mellom alkohol og parafin, da begge er løselige i den. FORSIKTIG: Toluen og parafin regnes som farlige materialer, da de kan være svært brannfarlige væsker og kan forårsake skade ved innånding eller kontakt med hud eller øyne. Sørg for å oppbevare dem tett lukket på et sikkert sted. Bruk riktig personlig verneutstyr når du håndterer dem. Kast avfall i henhold til lokale forskrifter om kjemisk fare. - Overfør den lukkede kassetten med organoid til et parafinbad i innebyggingsstasjonen.
- Ta kassetten fra badekaret, åpne den og overfør organoiden til en stålbaseform. Plasser formen under parafindispenseren, og dekk den helt med parafin.
- Plasser den tomme kassetten på toppen av stålbunnformen. Her legger du mer parafin på toppen av kassetten.
- Overfør stålbunnformen med kassetten på toppen til is, og la den avkjøles i 5 min. Fjern stålformen, og hold kassetten med organoiden innebygd i en parafinblokk.
- Overfør kassetten til en mikrotome for å kutte seksjoner. Klipp seksjoner etter ønske.
MERK: Her ble det laget seksjoner på 15 μm tykkelse i hele organoiden. - Slipp hver seksjon på overflaten av et vannbad satt til 45 ° C, og plukk det opp på et glassmikroskopglass.
- La skliene tørke i en kuvøse ved 42 °C over natten.
MERK: Lysbildene kan nå oppbevares i romtemperatur frem til fargetidspunktet. - Plasser lysbildet i en Coplin lysbilde fargeglass fylt med toluen i 2 minutter. Gjenta dette trinnet en gang til.
FORSIKTIG: Toluen regnes som et farlig materiale, da det kan være en svært brannfarlig væske og kan forårsake skade ved innånding eller kontakt med hud eller øyne. Sørg for å oppbevare den tett lukket på et sikkert sted. Bruk riktig personlig verneutstyr når du håndterer det. Kast avfall i henhold til lokale forskrifter om kjemisk fare. - Overfør til et glass Coplin lysbilde fargeglass fylt med EtOH 100% i 2 minutter. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Overfør til et glass Coplin lysbilde fargeglass fylt med destillert vann i 2 minutter. Gjenta dette trinnet en gang til.
- For uthenting av antigen, klargjør sitratbuffer (10 mM sitronsyre, 0,05% Tween 20, pH 6,0).
MERK: Citratbuffer kan oppbevares ved romtemperatur i opptil 3 måneder eller ved 4 °C for lengre oppbevaring. - Sett et vannbad mellom 95 °C og 100 °C.
FORSIKTIG: Dette vannbadet kan forårsake brannskader hvis man ikke er forsiktig. Ta alle nødvendige forholdsregler for å unngå direkte kontakt med badet eller dets komponenter. - I vannbadet, flyt en plastbeholder som kan passe lysbildene inni. Forsikre deg om at plasten ikke berører bunnen av badekaret (forutsatt at det er et bunnvarmebad) for å unngå smelting. Hell sitratbufferen inne i plastbeholderen, og la den nå 95-100 °C.
- Når bufferen når ønsket temperatur, plasser lysbildene inne i bufferen og dekk beholderen løst med et lokk. La lysbildene ligge inne i beholderen i vannbadet i 30-40 min.
- Fjern plastbeholderen fra vannbadet, og la den avkjøles ved romtemperatur i 20 min mer.
- Vask lysbildene i 3 x 2 min med PBS. Fjern PBS med et papirlommetørkle uten å berøre prøven eller tørke den over.
- Forbered permeabiliseringsbufferen (90 ml PBS + 0,1% Tween-20), og fyll en glassglassglassglass med den. Fordyp lysbildene i permeabiliseringsbufferen, og inkuber i 10 minutter.
- Vask lysbildene i 3 x 2 min med PBS.
- Forbered nok fargeblanding til å dekke hver prøve (~25 μL).
MERK: Se tabell 1 for antistoffene og de endelige konsentrasjonene som brukes her. - Tilsett 25 μL fargeblanding for å dekke hver organoidskive. Inkuberes i romtemperatur i 1 time eller over natten ved 4 °C i mørket.
NOTAT: Sørg for at prøvene forblir på høy luftfuktighet for å forhindre fordampning av fargeblandingen. Hvis en beholder for å holde lysbildene fuktige ikke er tilgjengelig, legg dem i en boks med noen våte vev på hjørnet. - Vask lysbildene i 3 x 2 min med PBS.
- Skyll en gang med destillert vann inne i en glassglass fargeglass krukke for å fjerne saltet.
- Tilsett 10 μL flytende monteringsmiddel + 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) til hver av prøvene.
MERK: Lysbildene kan forsegles hvis en andre runde med farging ikke utføres. Her var lysbildene ikke tildekket for å gi tilgang til slukking/restaining da fjerning av dekkslip kan skade vevet. - Bilde lysbildene ved hjelp av det valgte fluorescensmikroskopet.
MERK: Sørg for å ha positive og negative kontroller for hvert antistoff for å tillate riktig innstilling av intensiteter og eksponeringstider (for instrumentet som ble brukt her, ble belysningsintensiteten satt mellom 5 og 6 og eksponeringstiden mellom 2000 ms og 3000 ms), selv om dette kan variere avhengig av antistoffet. I tillegg må du sørge for at mikroskopet har tilstrekkelige detektorer for hver kanal som brukes. Vær oppmerksom på at siden prøvene ikke er dekket, må de plasseres med forsiden opp mens du avbilder dem. - Etter avbildning, tilbered fersk 2x bråkjølingsbuffer (9%H2O2+ 50 mM NaOH i PBS).
NOTAT: Slokkeløsningen må tilberedes frisk umiddelbart før du bruker den. Reaksjonen er følsom for aktiviteten til H2O2, som vil avta over tid. FORSIKTIG: H2O2 er irriterende, og NaOH er kaustisk. Disse bør behandles med egnet sikkerhetsutstyr, og hudkontakt bør unngås. Sørg for at de avhendes i samsvar med lokale retningslinjer for kjemisk sikkerhet. - Fyll glasset Coplin lysbilde fargeglass halvveis med 2x slukkebuffer (45 ml), legg til 45 ml PBS, og legg lysbildene inni. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Kontroller ved fluorescensmikroskopi at fluoroforene ble effektivt slukket.
- Gjenta farging og avbildning som ovenfor.
MERK: Slukking og restaining kan gjentas i flere runder etter behov, selv om risikoen for skade øker for hver ekstra runde.
5. Registrering av bilder
- Åpne FIJI.
- Lag en mappe med DAPI-bildene fra runde 1 og runde 2. Endre navnene for å tydeliggjøre hvilken, om nødvendig.
- Lag en tom mappe for utdata fra bilderegistreringen.
- Klikk på Plugins | Registrering | Registrer virtuelle stakkstykker.
- Under Kildekatalog velger du mappen som inneholder DAPI-bildene fra hver runde.
- Under Utdatakatalog velger du mappen som er laget for registreringsutgangen.
- Sett funksjonsutvinningsmodellen til Rigid og rullegardinmenyen Registreringsmodell til Rigid - oversett + roter for å fikse registreringen, slik at bildet bare kan flyttes og roteres for justering i stedet for å bli deformert.
MERK: Hvis deformasjon forventes, kan egenskapsekstraksjonsmodellen og registreringsmodellen justeres til Affine eller andre modeller etter ønske, selv om dette kan føre til uønskede transformasjoner. Av og til kan et stykke bli skadet mellom rundene, noe som kan forhindre vellykket registrering. - Merk av for Lagre transformeringer for å lagre transformasjonsparameterne, slik at de kan brukes på de andre kanalene.
- Klikk på OK.
- Velg stedet for å lagre transformeringsfilen (standard til inndatakatalogen), og klikk på Åpne.
- Velg DAPI-bildet som skal fungere som referanse for transformeringene. DAPI-bildet fra hver av de andre rundene vil bli justert til denne.
MERK: Når du er ferdig, vises de registrerte bildene som en stabel (og i utdatamappen). - Bruk glidebryteren nederst til å bla frem og tilbake mellom bildene for å bekrefte at bilderegistreringen var vellykket (kjernene er på samme sted i begge bildene, i hvert fall for de overlappende områdene).
- Kontroller at det er opprettet en .xml fil for hver runde med inndatabildene.
MERK: Disse inneholder oversettelsesparametrene som trengs for filene fra den runden. - Lag en mappe som inneholder alle bildene som skal registreres (hver kanal i hver runde). Legg merke til rekkefølgen på filene.
- Lag en mappe for transformasjonsparametrene, og lag en kopi av .xml filen for hver runde per kanal som skal registreres. Dobbeltsjekk at filrekkefølgen (etter navn) er den samme mellom bildene som skal registreres og kopiene av transformasjonsparameteren, da neste trinn vil gå gjennom og transformere hvert bilde i rekkefølgen til transformasjonsparameterfilene.
- Klikk på Plugins | Forvandle | Forvandle virtuelle stakkstykker.
- Under Kildekatalog velger du mappen som inneholder bildene som skal registreres.
- Under Utdatakatalog velger du mappen som er laget for registreringsutgangen.
- Under Transformerer katalog velger du mappen som inneholder de .xml filene med én kopi per bildefil som skal transformeres. Igjen, sørg for at rekkefølgen samsvarer med filene (dvs. en kopi av runde 1-.xml for hver runde 1-kanal, en kopi av runde 2-.xml for hver runde 2-kanal, etc.).
- Klikk på OK.
MERK: Når du er ferdig, vil de registrerte bildene fra den runden vises som en stabel (og i utdatamappen). - Bruk glidebryteren nederst til å vende frem og tilbake mellom kanalene. Kontroller at alle kanalene ble transformert på samme måte. Hvis ikke, skyldes dette sannsynligvis en feil .xml-fil i transformeringskatalogen; I dette tilfellet fikser du filen og gjentar.
MERK: Lysstyrkeområdet som vises, vil være basert på én kanal, men dette påvirker ikke de faktiske lagrede bildene, bare skjermen. - Vær oppmerksom på at alle de registrerte bildene er justert på tvers av runder og klare for overlegg/nedstrømsanalyse.
MERK: Det finnes mer effektive programmatiske måter å oppnå registrering for store batcher. Metoden som presenteres her er bare en enkel en som ikke krever programmering.
Representative Results
Som en validering av cerebral organoid identitet ble histologiske seksjoner av en moden (2 måneder gammel) cerebral organoid farget for PAX6 (en markør for dorsale NPCer23) og SATB2 (en markør for modne, postmitotiske, øvre lag nevroner24). Som forventet var PAX6+ -celler tilstede i organoidens indre, og SATB2+ -celler var tilstede i de øvre lagene (figur 2). Disse resultatene støtter at de cerebrale organoidene som ble brukt, faktisk var dorsale forhjerner som spesifisert i differensieringssettet. For å etablere doseavhengigheten av det cerebrale organoidtransplantasjonssystemet ble 2 måneder gamle cerebrale organoider injisert med økende antall EGFP + iPSC-avledede NPCer. En klar doseavhengighet av GFP-fluorescens på inngangscellenummer var tilstede, med konsistent EGFP + cellelappdeteksjon ved 10 000 celler og over (figur 3). Persistens og migrasjon av de transplanterte NPC-ene ble deretter vurdert ved å følge de transplanterte organoidene over tid. For dette ble 50 000 iPSC-avledede EGFP + NPCer transplantert til 2-3 måneder gamle cerebrale organoider generert fra samme iPSC-linje. De injiserte organoidene og kontrollene ble avbildet for EGFP-positivitet ved angitte tidspunkter i løpet av de neste 3-4 månedene. I denne transplantasjonsserien observerte vi varigheten av det injiserte stedet gjennom hele 4 måneders sporingsperioden (figur 4A). Ytterligere EGFP+ -celleplastre dukket opp 9 dager etter transplantasjonen og vedvarte til studiens endepunkt (3-4 måneder avhengig av organoid), noe som indikerer migrasjon av cellene og integrasjon på deres nye steder (figur 4A). Ved høyere forstørrelse kunne man observere klar nevral morfologi med lange fremspring i organoiden (figur 4B), noe som bekreftet integrasjonen av de injiserte cellene.
For å bestemme differensieringsstatusen til de injiserte cellene sent etter injeksjon, ble den 4 måneders sporede organoiden og dens kontroll festet, parafininnebygd, kuttet til 15 μm tykke skiver og montert på glassglass. Skivene ble deretter behandlet og farget i enten en enkelt runde fluorescerende farging (EGFP, TUJ1, NESTIN) eller i to påfølgende fargesykluser for å legge til flere markører (MAP2, GFAP). Den første enkeltrundfargingen bekreftet tilstedeværelsen av EGFP+-celler på injeksjonsstedet, inkludert en blanding av celler som beholdt NPC-status (NESTIN+TUJ1−) og de som hadde differensiert mot en nevral skjebne (NESTIN−TUJ1+) (figur 5). For både kontrollorganoider og injiserte organoider ble det observert svært få NESTIN+ NPC-er (de fleste, men ikke alle, var EGFP+-transplanterte NPC-er på injeksjonsstedet), med et flertall av TUJ1+ umodne nevroner (figur 5). Den to-runde fargingen ga flere detaljer, og avslørte modne nevroner (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) rundt det meste av organoidens ytre region, med områder med umodne (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) nevroner mot midten (figur 6A,B). Astrocytter (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) fantes både i injiserte organoider og kontrollorganoider og var spredt rundt ytterkantene (figur 6A,B). Skiven som den to-runde fargingen ble utført for i den injiserte organoiden, viste en liten satellittkoloni av EGFP + -celler langt fra injeksjonsstedet som hadde adoptert fenotypen til modne nevroner (figur 6B, C). Noen av disse syntes å være i nærheten av astrocytter; Det var imidlertid ingen EGFP+-celler med fullstendig overlapping med GFAP-fargingen, noe som tyder på at de var tilstøtende snarere enn å generere astrocyttene selv (figur 6B,C).
Figur 1 Transplantasjonsmodell av merkede celler til cerebrale organoider. Skjematisk oversikt over generering av merkede celler ved lentiviral transduksjon, transplantasjon i cerebrale organoider og sporing ved levende celleavbildning og immunfluorescens. Forkortelse: GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Immunfluorescens av histologiske snitt som viser arkitekturen til tidlige og sene organoider. En 2 måneder gammel cerebral organoid ble fikset, parafin-innebygd, skiver og farget med PAX6, SATB2 og DAPI. En ufarget seksjon ble brukt til å stille inn eksponerings- og integrasjonstid for å unngå et falskt positivt signal fra autofluorescens. PAX6+-celler var tilstede i organoidens indre, mens SATB2+-celler var tilstede i de øvre lagene. Z-stack-bilder ble tatt hver 4,2 μm gjennom hele 15 μm vevssnitt. Optiske seksjoner ble kombinert ved hjelp av fokusstablingsalternativet i Gen5-programvaren med standardalternativer. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: PAX6 = parret boks 6 protein; SATB2 = spesielt AT-rikt sekvensbindende protein 2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Doseavhengig innblanding av NPC i cerebrale organoider. Organoidene ble transplantert med 0 (negativ kontroll), 1000, 5000, 10 000 eller 50 000 GFP + iPSC-avledede NPC-er. 1 uke etter transplantasjonen ble organoidene avbildet på en cytasjon 5 med en GFP-filterkube. Den negative kontrollen ble brukt til å stille inn eksponerings- og integrasjonstid for å minimere autofluorescens. Mørkere farger indikerer mer EGFP-fluorescens i forhold til den negative kontrollen. Skalastenger = 100 μm. Dette er 4x bilder av hele organoider. Etter avbildning ble rullekulebakgrunnssubtraksjon med en pikselradius på 50 utført før visning for å korrigere for den variable bakgrunnsintensiteten over organoidene. Injeksjonssteder identifisert som regionene med høyest transplantasjon er indikert med en rød pil der transplantasjon var til stede. Forkortelser: NPCer = nevrale stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein; EGFP = forbedret GFP; iPSC = indusert pluripotent stamcelle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sporing av transplantert cellevekst, migrasjon og utholdenhet med fluorescens levende celleavbildning. (A) Kontroll- og transplanterte (50 000 GFP + iPSC-avledede NPC-er) organoider ble etterfulgt av fluorescens levende celleavbildning i løpet av 2-4 måneder fra to uavhengige transplantasjonssett. Negative kontrollorganoider ble brukt til å stille inn eksponerings- og integrasjonstiden for å minimere autofluorescensen ved hvert tidspunkt. EGFP-bilder ble tatt med en GFP-filterkube på Cytation 5 på angitte tidspunkter etter transplantasjonen. Mørkere farger indikerer mer EGFP-fluorescens i forhold til den negative kontrollen for det tidspunktet. Rullekulebakgrunnssubtraksjon med en pikselradius på 50 ble utført før visning for å korrigere for den variable bakgrunnsintensiteten over organoidene. Organoidene ble plassert i omtrent samme retning på hvert tidspunkt, og bildene ble rotert for konsistens av skjermen og for å tydelig vise den transplanterte celleveksten. Injeksjonsstedene som tidligst er identifisert som områdene med høyest transplantasjon, er angitt med rød pil. Et eksempel på negativ kontrollorganoid er vist nederst på figuren. (B) Eksempel 20x bilder er vist fra enpodede organoider ved uke 1 og uke 15 etter transplantasjon. Den lokale kontrasten ble forsterket før visning ved bruk av FIJI for å sikre nevrittsynlighet. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: NPCer = nevrale stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein; EGFP = forbedret GFP; iPSC = indusert pluripotent stamcelle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Immunfluorescens av histologiske snitt som viser persistens av de transplanterte NPCene på injeksjonsstedet sammen med migrasjon og nevral differensiering. Enkeltkanals fluorescensbilder fra (A) ikke-injiserte og (B) transplanterte organoider. Det overliggende bildet til høyre viser de tre kanalene av interesse (NESTIN, TUJ1 og EGFP), men inkluderer ikke DAPI. Skjermminimumene ble satt til bare å ekskludere signalet fra de negative cellene (bestemt for EGFP fra den ikke-injiserte kontrollen og for andre kanaler basert på kjente markørkombinasjoner). Visningsmaksimumene var basert på det høyeste signalet som ble observert for det antistoffet i en hvilken som helst celle. Visningsområdene ble holdt konstant mellom de ikke-injiserte og transplanterte organoidene for å muliggjøre direkte sammenligning. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: NPCer = nevrale stamceller; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TUJ1 = beta-III tubulin; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 Vurdering av transplantert celledifferensieringstilstand og lokalisasjon med syklisk immunfluorescens av histologiske snitt. Enkeltkanals fluorescensbilder fra ikke-injiserte, (A) aldersmatchede og (B) transplanterte organoider vises for første og andre runde med farging som angitt. Skjermminimumene ble satt til bare å ekskludere signalet fra de negative cellene (bestemt for EGFP fra den ikke-injiserte kontrollen og for andre kanaler basert på kjente markørkombinasjoner). Visningsmaksimumene var basert på det høyeste signalet som ble observert for det antistoffet i en hvilken som helst celle. Visningsområdene (og selvfølgelig bildeparametrene) ble holdt konstant mellom kontrollen og injiserte organoider for å muliggjøre direkte sammenligning. Skalastenger = 100 μm. Et overlagt bilde (unntatt DAPI) vises for hver fargingsrunde for hver organoid til høyre. (B) For den injiserte organoiden der bilderegistreringen ble utført, blir alle bildene beskåret til regionen observert i begge fargerundene. (B,C) For den injiserte organoiden er EGFP + celleregionene skissert i blått. Et diagram over hvordan DAPI brukes til å matche funksjonene under bilderegistrering, vises i (C), etterfulgt av en generell sammenslåing av det registrerte bildet. Forkortelser: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TUJ1 = beta-III tubulin; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; MAP2 = mikrotubuli-assosiert protein 2; GFAP = glialfibrillært surt protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Klon | Fluorofor | Konsentrasjon | |
| Anti-NESTIN | 10C2 | AlexaFluor 594 | 1 av 2 000 |
| Anti-TUBB3 | TUJ1 | AlexaFluor 647 | 1 av 2 000 |
| Anti-GFP | FM264G | AlexaFluor 488 | 1 til 200 |
| Anti-GFAP | SMI 25 | AlexaFluor 594 | 1 til 500 |
| Anti-MAP2 | SMI 52 | AlexaFluor 488 | 1 til 1 000 |
| Anti-PAX6 | O18-1330 | AlexaFluor 647 | 1 av 100 |
| Anti-SATB2 | EPNCIR130A | AlexaFluor 594 | 1 til 500 |
Tabell 1: Antistoffkonsentrasjoner for farging. Forkortelser: TUBB3 = beta-tubulin III; GFP = grønt fluorescerende protein; GFAP = glial fibrillær surt protein; MAP2 = mikrotubuli-assosiert protein 2; PAX6 = parret boks 6 protein; SATB2 = spesielt AT-rikt sekvensbindende protein 2.
Discussion
Gitt den betydelige interessen for celleterapeutiske tilnærminger for behandling av CNS-skader / nevrodegenerative lidelser 1,2,3,4,5,6,7,8, blir modeller av cellefunksjon i en transplantasjonsinnstilling stadig viktigere. Denne artikkelen presenterer en metode for transplantasjon av merkede, humane NPCer i humane cerebrale organoider, sammen med deres live-cellesporing og endepunktsvurdering ved histologi og immunfluorescerende farging. Det er viktig at vi viste at de transplanterte cellene var i stand til migrasjon, differensiering og langsiktig (4 måneder) utholdenhet i organoidinnstillingen. Slik langvarig utholdenhet er en markant økning i forhold til vedlikeholdsevnen til hjerneskivekulturer17. Dette systemet er dermed hensiktsmessig for å undersøke mange av atferdene man trenger å vurdere i en potensiell terapeutisk setting, for eksempel overlevelse, spredning og differensiering. Faktisk viste en ortogonal studie nylig at transplanterte NPCer oppførte seg på samme måte i cerebrale organoider sammenlignet med NPCer transplantert i NSG-musehjerner20, og bekreftet dermed nytten av organoider som transplantasjonsmottaker. Siden dette er et in vitro-system, er det også enkelt å legge til cytokiner eller legemidler av interesse. Dette kan brukes til å bedre forstå effekten av spesifikke miljøer som betennelse og immunosuppressiva på de transplanterte cellene for ytterligere å etterligne hva de kan støte på i en terapeutisk setting. Den sykliske immunfluorescensprotokollen vi demonstrerte (basert på tidligere forskning21) utvider kraften i denne tilnærmingen ytterligere, slik at et bredt spekter av avstamnings- og potensielt sykdomsspesifikke markører samtidig kan vurderes i en enkelt seksjon, og dermed tillate nøyaktig sporing av de transplanterte cellene og deres innvirkning på vevet. Selvfølgelig kan andre endepunktvurderingsmetoder brukes i stedet, avhengig av målene for analysen. For eksempel kan vevsrydding med 3D-rekonstruksjon brukes hvis cellemorfologi er av primær interesse, eller dissosiasjon etterfulgt av flowcytometri kan brukes hvis kvantifisering av spesifikke celletyper er sluttmålet. Vi forventer at denne metoden vil være lett utvidbar til andre celletyper som CNS-svulster, noe som potensielt tillater deres studie i en mikromiljømessig relevant sammenheng. På samme måte kan organoider som brukes som mottakere byttes ut med sykdomsmodellorganoider 25,26,27, noe som potensielt muliggjør modellering av transplantasjonstilnærminger for disse forholdene.
Som med alle modeller har den som presenteres her også sine egne begrensninger. For det første er iPSC-avledede organoider utviklingsmessig umodne19 og har dermed viktige forskjeller sammenlignet med den aldrende hjernen, der mange nevrodegenerative sykdommer manifesterer seg. Cerebrale organoider er også ujevne i utvikling19, og utelukker dermed konsekvent injeksjon i samme eksakte fysiologiske nisje. Dessuten, mens de inneholder celletypene til de relevante hjernegruppene18,19, mangler de endotel-, mikroglial- og immunkomponentene, som også er viktige i in vivo-innstillingen 14. Dette begrenser studiet av hvordan verten vil reagere på celletransplantasjonen. Teknikker kommer for tiden online for å legge til vaskulære28 og mikrogliale29-celler, samt å øke organoidkonsistensen og regionaliseringen18, og dermed forbedre modelleringskraften til organoidtransplantasjonssystemet. De vil imidlertid kreve ytterligere testing og optimalisering utover det som presenteres her. Selv om denne protokollen er billig og ikke krever spesialutstyr, er det fortsatt en rekke viktige tekniske hensyn - injeksjonsdybden, for eksempel. Dette skyldes både at organoider ikke er perfunderte og dermed ofte har et nekrotisk senter hvis de blir for store19 og at lyset ikke kan trenge gjennom organoidkjernen for levende cellesporing. Dermed kan cellene som har blitt injisert for dypt og kolonier som har migrert inne, bli savnet. Selv om dette kan forbedres ved bruk av fluoroforer med lengre bølgelengde med bedre vevspenetrans30, avhengig av organoidstørrelsen og deteksjonsapparatet, vil dette sannsynligvis forbli en vurdering. Til slutt, ettersom hjerneorganoider er i en tilstand av utvikling, er transplantasjonstidspunktet et annet viktig hensyn, da miljøet sannsynligvis vil variere avhengig av utviklingsstadiet av organoiden som den injiseres i. Selv om dette til en viss grad kan kontrolleres ved å sikre en konsistent organoid alder på injeksjonstidspunktet, er det uten tvil en faktor som må vurderes.
Denne protokollen er billig, enkel, dyrefri og krever ikke spesialutstyr, noe som gjør transplantasjonsmodellering tilgjengelig for et bredere utvalg av laboratorier. Med den raske utviklingen både i nevrale celleterapier og organoide modellsystemer, forventer vi at organoidtransplantasjonsprotokollen som presenteres her, vil være en nyttig modell for en rekke sykdommer og terapeutiske tilnærminger.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Midler til dette arbeidet ble gitt gjennom IRIC Philanthropic midler fra Marcelle og Jean Coutu stiftelsen og fra Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS #295647). D.J.H.F.K. har lønnsstøtte fra FRQS i form av et Chercheurs-boursiers Junior 1-stipend (#283502). M.I.I.R. ble støttet av en IRIC doktorgradspris fra Institut of Research in Immunology and Cancer, en Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat fra University of Montreal, og Bourse de Mérite aux cycles supérieurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | proteolytic-collagenolytic enzyme mix |
| Alexa Fluor 488 anti-GFP Antibody | BioLegend | 338008 | |
| Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (clone SMI 52) | BioLegend | 801804 | |
| Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antibody (clone SMI 25) | BioLegend | 837510 | |
| Alexa Fluor 594 anti-Nestin (clone 10C2) | BioLegend | 656804 | |
| Alexa Fluor 647 anti-Tubulin β 3 (TUBB3) (clone TUJ1) | BioLegend | 801209 | |
| Citric Acid Monohydrate | Fisher Chemical | A104-500 | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | - | |
| Denaturated Ethyl Alcohol (Anhydrous) | ChapTec | - | |
| DMEM F12/Glutamax | Thermo | 10565018 | |
| Dymethil Sulfoxide (DMSO), Sterile | BioShop | DMS666.100 | |
| FIJI 1.53c | - | - | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Gen5 | - | - | |
| HistoCore Arcadia H | Leica Biosystems | - | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | Phenol Red-free, LDEV-free |
| MX35 microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| NaOH | Sigma | 655104 | |
| PBS (-Ca -Mg) | Sigma | D8537 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo | A1113803 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Abcam | ab120129 | |
| Simport Scientific Stainless-Steel Base Molds | Fisher Scientific | 22-038-209 | |
| Simport Scientific UNISETTE Biopsy Processing/Embedding Cassette | Fisher Scientific | 36-101-9255 | |
| STEMdiff Forebrain Neuron Differentiation Kit | StemCell Technologies | 8600 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Medium | StemCell Technologies | 5833 | |
| STEMdiff SMADi Neural Induction Kit | StemCell Technologies | 8581 | |
| Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome | Thermo Scientific | - | |
| Tissue Prep | Fisher Scientific | T555 | |
| Tissue-Tek VIP 6 AI Tissue Processor | Sakura Finetek | - | |
| Toluene (histological) | ChapTec | - | |
| Trypan blue; 0.4% (wt/vol) | Thermo | 15250061 | |
| Tween 20 | BioShop | TWN510.100 |
References
- Spurlock, M. S., et al. Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells. Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981 (2017).
- Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301 (2019).
- Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models. Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29 (2020).
- Kefalopoulou, Z., et al. Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports. JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).
- Li, W., et al. Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).
- Takahashi, J. iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial. Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).
- Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. Cell-based therapies for stroke: Are we there yet. Frontiers in Neurology. 10, 656 (2019).
- Coles-Takabe, B. L. K., et al. Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Li, J., et al. Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes. Nature Communications. 12 (1), 3958 (2021).
- Morizane, A., et al. MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates. Nature Communications. 8 (1), 385 (2017).
- Khrameeva, E., et al. Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains. Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).
- Powell, K. Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals. Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- García-Delgado, A. B., et al. Brain organoids to evaluate cellular therapies. Animals. 12 (22), (2022).
- Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method. Nature Communications. 6 (1), 8390 (2015).
- Knapp, D. J. H. F., et al. Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential. Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).
- Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J.
- Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
- Kim, H., et al. Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids. Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).
- Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinson's Disease. 5, 5 (2019).
- Jin, M., et al. Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease. Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).
- Sun, X. -Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, e76707 (2022).
- Popova, G., et al. Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids. Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).
- Wang, S., Li, B., Zhang, F. Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging. ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).
