Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi
Summary
Burada, ateşböceği lusiferazını kodlayan mRNA’yı kapsülleyen lipid nanopartiküllerini (LNP’ler) formüle etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu LNP’ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo potansiyelleri açısından test edildi.
Abstract
Lipid nanopartikülleri (LNP’ler), Moderna ve Pfizer/BioNTech tarafından COVID-19 mRNA aşılarının başarılı bir şekilde geliştirilmesiyle son zamanlarda büyük ilgi görmüştür. Bu aşılar, mRNA-LNP terapötiklerinin etkinliğini göstermiş ve gelecekteki klinik uygulamalar için kapıyı açmıştır. mRNA-LNP sistemlerinde, LNP’ler, mRNA kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı koruyan ve hücre içi iletimlerine aracılık eden dağıtım platformları olarak hizmet eder. LNP’ler tipik olarak dört bileşenden oluşur: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen glikol (PEG) konjugatı (lipid-PEG). Burada, ateşböceği lusiferazı kodlayan mRNA’yı kapsülleyen LNP’ler, LNP lipid bileşenlerini içeren organik fazın ve mRNA içeren sulu fazın mikroakışkan karışımı ile formüle edilir. Bu mRNA-LNP’ler daha sonra biyolüminesan plaka bazlı bir test kullanılarak HepG2 hücrelerinde transfeksiyon verimliliklerini değerlendirmek için in vitro olarak test edilir. Ek olarak, mRNA-LNP’ler, lateral kuyruk damarı yoluyla intravenöz bir enjeksiyonu takiben C57BL/6 farelerinde in vivo olarak değerlendirilir. Tüm vücut biyolüminesans görüntüleme, in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. mRNA-LNP özellikleri, HepG2 hücrelerindeki transfeksiyon etkinlikleri ve C57BL/6 farelerinde toplam ışıldayan akı için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Introduction
Lipid nanopartikülleri (LNP’ler) son yıllarda viral olmayan gen terapisi alanında büyük umut vaat etmektedir. 2018’de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), kalıtsal transtirenin amiloidozu 1,2,3,4’ün tedavisi için ilk RNA interferansı (RNAi) terapötik olan Onpattro by Alnylam’ı onayladı. Bu, lipid nanopartikülleri ve RNA bazlı tedaviler için ileriye doğru atılmış önemli bir adımdı. Daha yakın zamanlarda, Moderna ve Pfizer/BioNTech, SARS-CoV-2 4,5’e karşı mRNA-LNP aşıları için FDA onayları aldı. Bu LNP bazlı nükleik asit tedavilerinin her birinde, LNP, kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı korumaya ve güçlü hücre içi iletimi kolaylaştırmaya hizmet eder 6,7. LNP’ler RNAi tedavilerinde ve aşı uygulamalarında başarı elde ederken, mRNA-LNP’ler ayrıca protein replasman tedavilerinde8 kullanım için ve ayrıca Cas9 mRNA’nın birlikte verilmesi ve gen düzenleme için CRISPR-Cas9 sisteminin verilmesi için RNA’yı yönlendirmek için araştırılmıştır9. Bununla birlikte, tüm uygulamalar için uygun olan tek bir spesifik formülasyon yoktur ve LNP formülasyon parametrelerindeki ince değişiklikler, in vivo 8,10,11 gücünü ve biyolojik dağılımı büyük ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, her LNP bazlı tedavi için optimal formülasyonu belirlemek için bireysel mRNA-LNP’ler geliştirilmeli ve değerlendirilmelidir.
LNP’ler genellikle dört lipid bileşeni ile formüle edilir: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen-glikol (PEG) konjugatı (lipit-PEG)11,12,13. LNP’ler tarafından kolaylaştırılan güçlü hücre içi iletim, kısmen iyonlaşabilir lipid bileşeni12’ye dayanır. Bu bileşen fizyolojik pH’ta nötrdür, ancak endozom11’in asidik ortamında pozitif yüklü hale gelir. İyonik yükteki bu değişikliğin endozomal kaçışa önemli bir katkıda bulunduğu düşünülmektedir12,14,15. İyonize olabilen lipide ek olarak, fosfolipid (yardımcı lipid) bileşeni, yükün kapsüllenmesini iyileştirir ve endozomal kaçışa yardımcı olur, kolesterol stabilite sağlar ve membran füzyonunu arttırır ve lipid-PEG, dolaşımda LNP agregasyonunu ve opsonizasyonu en aza indirir10,11,14,16. LNP’yi formüle etmek için, bu lipit bileşenleri organik bir fazda, tipik olarak etanolde birleştirilir ve nükleik asit kargosunu içeren sulu bir faz ile karıştırılır. LNP formülasyon işlemi, çok sayıda fizikokimyasal özelliğe sahip birçok LNP formülasyonunu formüle etmek için farklı bileşenlerin kolayca ikame edilmesine ve farklı molar oranlarda birleştirilmesine izin vermesi bakımından çok yönlüdür10,17. Bununla birlikte, bu çok çeşitli LNP’leri keşfederken, karakterizasyon ve performanstaki farklılıkları doğru bir şekilde ölçmek için her formülasyonun standart bir prosedür kullanılarak değerlendirilmesi çok önemlidir.
Burada, mRNA-LNP’lerin formülasyonu ve hücrelerde ve hayvanlarda performanslarının değerlendirilmesi için eksiksiz iş akışı özetlenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iş akışıyla, çeşitli mRNA-LNP’ler in vitro ve in vivo verimlilikleri için formüle edilebilir ve test edilebilir. İyonlaşabilir lipitler ve eksipiyanlar, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip mRNA-LNP’ler üretmek için farklı molar oranlarda ve farklı iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranlarında değiştirilebilir ve birleştirilebilir22. Burada, molar oranı 35/16/46.5/2.5 (iyonlaşabilir lipid: yardımcı lipid: kolesterol: lipid-PEG) olan C12-200 mRNA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M., ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü’nden (DP2 TR002776), Scientific Interface’de (CASI) Burroughs Wellcome Fund Kariyer Ödülü’nden, ABD Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödülünden (CBET-2145491) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ve NIDDK R01 DK123049) ek fon sağladığını kabul eder.
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
