Testen van de in vitro en in vivo efficiëntie van mRNA-lipide nanodeeltjes geformuleerd door microfluïdische menging
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het formuleren van lipide nanodeeltjes (LNP’s) die mRNA inkapselen dat codeert voor vuurvliegluciferase. Deze LNP’s werden in vitro getest op hun werkzaamheid in HepG2-cellen en in vivo in C57BL/6-muizen.
Abstract
Lipide nanodeeltjes (LNP’s) hebben de laatste tijd veel aandacht getrokken met de succesvolle ontwikkeling van de COVID-19 mRNA-vaccins door Moderna en Pfizer/BioNTech. Deze vaccins hebben de werkzaamheid van mRNA-LNP-therapieën aangetoond en de deur geopend voor toekomstige klinische toepassingen. In mRNA-LNP-systemen dienen de LNP’s als leveringsplatforms die de mRNA-lading beschermen tegen afbraak door nucleasen en hun intracellulaire afgifte bemiddelen. De LNP’s bestaan doorgaans uit vier componenten: een ioniseerbaar lipide, een fosfolipide, cholesterol en een lipide-verankerd polyethyleenglycol (PEG)-conjugaat (lipide-PEG). Hier worden LNP’s die mRNA inkapselen dat codeert voor vuurvliegluciferase geformuleerd door microfluïdische menging van de organische fase met LNP-lipidecomponenten en de waterige fase die mRNA bevat. Deze mRNA-LNP’s worden vervolgens in vitro getest om hun transfectie-efficiëntie in HepG2-cellen te evalueren met behulp van een bioluminescente plaatgebaseerde test. Bovendien worden mRNA-LNP’s in vivo geëvalueerd bij C57BL/6-muizen na een intraveneuze injectie via de laterale staartader. Bioluminescentiebeeldvorming van het hele lichaam wordt uitgevoerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem. Representatieve resultaten worden getoond voor de mRNA-LNP-kenmerken, hun transfectie-efficiëntie in HepG2-cellen en de totale luminescente flux in C57BL/6-muizen.
Introduction
Lipide nanodeeltjes (LNP’s) zijn de afgelopen jaren veelbelovend gebleken op het gebied van niet-virale gentherapie. In 2018 keurde de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) het allereerste RNA-interferentietherapeutisch middel (RNAi), Onpattro van Alnylam, goed voor de behandeling van erfelijke transthyretine-amyloïdose 1,2,3,4. Dit was een belangrijke stap voorwaarts voor lipide nanodeeltjes en RNA-gebaseerde therapieën. Meer recentelijk ontvingen Moderna en Pfizer/BioNTech FDA-goedkeuringen voor hun mRNA-LNP-vaccins tegen SARS-CoV-2 4,5. In elk van deze op LNP gebaseerde nucleïnezuurtherapieën dient de LNP om zijn lading te beschermen tegen afbraak door nucleasen en om krachtige intracellulaire afgifte te vergemakkelijken 6,7. Hoewel LNP’s succes hebben geboekt in RNAi-therapieën en vaccintoepassingen, zijn mRNA-LNP’s ook onderzocht voor gebruik in eiwitvervangende therapieën8 en voor de gelijktijdige afgifte van Cas9-mRNA en gids-RNA voor de levering van het CRISPR-Cas9-systeem voor genbewerking9. Er is echter niet één specifieke formulering die geschikt is voor alle toepassingen, en subtiele veranderingen in de LNP-formuleringsparameters kunnen de potentie en biodistributie in vivo sterk beïnvloeden 8,10,11. Individuele mRNA-LNP’s moeten dus worden ontwikkeld en geëvalueerd om de optimale formulering voor elke op LNP gebaseerde therapie te bepalen.
LNP’s worden gewoonlijk geformuleerd met vier lipidecomponenten: een ioniseerbaar lipide, een fosfolipide, cholesterol en een lipide-verankerd polyethyleenglycol (PEG)-conjugaat (lipide-PEG)11,12,13. De krachtige intracellulaire afgifte die door LNP’s wordt gefaciliteerd, is gedeeltelijk afhankelijk van de ioniseerbare lipidecomponent12. Deze component is neutraal bij fysiologische pH, maar wordt positief geladen in de zure omgeving van het endosoom11. Deze verandering in ionische lading wordt verondersteld een belangrijke bijdrage te leveren aan endosomale ontsnapping12,14,15. Naast het ioniseerbare lipide verbetert de fosfolipidecomponent (helperlipide) de inkapseling van de lading en helpt bij endosomale ontsnapping, het cholesterol biedt stabiliteit en verbetert de membraanfusie, en de lipide-PEG minimaliseert LNP-aggregatie en opsonisatie in circulatie10,11,14,16. Om het LNP te formuleren, worden deze lipidecomponenten gecombineerd in een organische fase, meestal ethanol, en gemengd met een waterige fase die de nucleïnezuurlading bevat. Het LNP-formuleringsproces is zeer veelzijdig omdat het het mogelijk maakt om verschillende componenten gemakkelijk te vervangen en te combineren in verschillende molaire verhoudingen om veel LNP-formuleringen te formuleren met een veelheid aan fysisch-chemische eigenschappen10,17. Bij het verkennen van deze grote verscheidenheid aan LNP’s is het echter van cruciaal belang dat elke formulering wordt geëvalueerd met behulp van een gestandaardiseerde procedure om de verschillen in karakterisering en prestaties nauwkeurig te meten.
Hier wordt de volledige workflow voor de formulering van mRNA-LNP’s en de beoordeling van hun prestaties in cellen en dieren geschetst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met deze workflow kan een verscheidenheid aan mRNA-LNP’s worden geformuleerd en getest op hun in vitro en in vivo efficiëntie. Ioniseerbare lipiden en hulpstoffen kunnen worden verwisseld en gecombineerd met verschillende molaire verhoudingen en verschillende ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhoudingen om mRNA-LNP’s te produceren met verschillende fysisch-chemische eigenschappen22. Hier formuleerden we C12-200 mRNA-LNP’s met een molaire verhouding van 35/16/46,5/2,5 (ioniseerb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. erkent de steun van een Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) Director’s New Innovator Award (DP2 TR002776), een Burroughs Wellcome Fund Career Award bij de Scientific Interface (CASI), een US National Science Foundation CAREER Award (CBET-2145491) en aanvullende financiering van de National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 en NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
