Tester l’efficacité in vitro et in vivo de nanoparticules d’ARNm-lipides formulées par mélange microfluidique
Summary
Ici, un protocole de formulation de nanoparticules lipidiques (LNP) qui encapsulent l’ARNm codant pour la luciférase lucifly est présenté. Ces LNP ont été testés pour leur puissance in vitro dans des cellules HepG2 et in vivo chez des souris C57BL/6.
Abstract
Les nanoparticules lipidiques (LNP) ont récemment attiré l’attention avec le développement réussi des vaccins à ARNm contre la COVID-19 par Moderna et Pfizer/BioNTech. Ces vaccins ont démontré l’efficacité des thérapies à base d’ARNm-LNP et ont ouvert la voie à de futures applications cliniques. Dans les systèmes ARNm-LNP, les LNP servent de plates-formes d’administration qui protègent la cargaison d’ARNm de la dégradation par les nucléases et interviennent dans leur livraison intracellulaire. Les LNP sont généralement composés de quatre composants : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué de polyéthylène glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG). Ici, les LNP encapsulant l’ARNm codant pour la luciférase luciole sont formulés par mélange microfluidique de la phase organique contenant les composants lipidiques du LNP et de la phase aqueuse contenant l’ARNm. Ces ARNm-LNP sont ensuite testés in vitro pour évaluer leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 à l’aide d’un test bioluminescent sur plaque. De plus, les ARNm-LNP sont évalués in vivo chez des souris C57BL/6 à la suite d’une injection intraveineuse via la veine caudale latérale. L’imagerie par bioluminescence du corps entier est réalisée à l’aide d’un système d’imagerie in vivo . Des résultats représentatifs sont présentés pour les caractéristiques de l’ARNm-LNP, leur efficacité de transfection dans les cellules HepG2 et le flux luminescent total chez les souris C57BL/6.
Introduction
Les nanoparticules lipidiques (LNP) se sont révélées très prometteuses ces dernières années dans le domaine de la thérapie génique non virale. En 2018, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a approuvé le tout premier traitement d’interférence ARN (ARNi), Onpattro d’Alnylam, pour le traitement de l’amylose héréditaire à transthyrétine 1,2,3,4. Il s’agit d’une avancée importante pour les nanoparticules lipidiques et les thérapies à base d’ARN. Plus récemment, Moderna et Pfizer/BioNTech ont reçu l’approbation de la FDA pour leurs vaccins à ARNm-LNP contre le SRAS-CoV-2 4,5. Dans chacune de ces thérapies à base d’acides nucléiques à base de LNP, le LNP sert à protéger sa cargaison de la dégradation par les nucléases et à faciliter une administration intracellulaire puissante 6,7. Alors que les LNP ont connu du succès dans les thérapies à base d’ARNi et les applications vaccinales, les ARNm-LNP ont également été explorés pour une utilisation dans les thérapies de remplacement des protéines8 ainsi que pour la co-livraison de l’ARNm Cas9 et de l’ARN guide pour l’administration du système CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes9. Cependant, il n’existe pas de formulation spécifique qui convienne à toutes les applications, et des changements subtils dans les paramètres de formulation du LNP peuvent grandement affecter la puissance et la biodistribution in vivo 8,10,11. Ainsi, des ARNm-LNP individuels doivent être développés et évalués afin de déterminer la formulation optimale pour chaque thérapie à base de LNP.
Les LNP sont généralement formulés avec quatre composants lipidiques : un lipide ionisable, un phospholipide, du cholestérol et un conjugué polyéthylène-glycol (PEG) ancré dans les lipides (lipide-PEG)11,12,13. La puissante délivrance intracellulaire facilitée par les LNP repose, en partie, sur le composant lipidique ionisable12. Ce composant est neutre au pH physiologique mais se charge positivement dans l’environnement acide de l’endosome11. On pense que ce changement de charge ionique est un contributeur clé à l’échappement endosomal12,14,15. En plus du lipide ionisable, le composant phospholipide (lipide auxiliaire) améliore l’encapsulation de la cargaison et aide à l’échappement endosomal, le cholestérol offre une stabilité et améliore la fusion membranaire, et le lipide-PEG minimise l’agrégation et l’opsonisation du LNP dans la circulation10,11,14,16. Pour formuler le LNP, ces composants lipidiques sont combinés dans une phase organique, généralement de l’éthanol, et mélangés à une phase aqueuse contenant la cargaison d’acide nucléique. Le procédé de formulation du LNP est très polyvalent en ce sens qu’il permet de substituer et de combiner facilement différents composants à différents rapports molaires afin de formuler de nombreuses formulations de LNP avec une multitude de propriétés physico-chimiques10,17. Cependant, lors de l’exploration de cette grande variété de LNP, il est crucial que chaque formulation soit évaluée à l’aide d’une procédure standardisée pour mesurer avec précision les différences de caractérisation et de performance.
Ici, le flux de travail complet pour la formulation des ARNm-LNP et l’évaluation de leurs performances dans les cellules et les animaux sont décrits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grâce à ce flux de travail, une variété d’ARNm-LNP peuvent être formulés et testés pour leur efficacité in vitro et in vivo. Les lipides et les excipients ionisables peuvent être échangés et combinés à différents rapports molaires et à différents rapports de poids lipides/ARNm ionisables pour produire des ARNm-LNP ayant des propriétés physico-chimiques différentes22. Ici, nous avons formulé des ARNm-LNP C12-200 avec un rapport molaire de 35/16/46,5/2,5 (lipi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. reconnaît le soutien d’un prix du directeur des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis (DP2 TR002776), d’un Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), d’un prix CAREER de la National Science Foundation des États-Unis (CBET-2145491) et d’un financement supplémentaire des National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 et NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
