マイクロ流体混合で調製したmRNA-脂質ナノ粒子のin vitro および in vivo 効率の試験
Summary
ここでは、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAをカプセル化する脂質ナノ粒子(LNP)を製剤化するためのプロトコルが提示されます。これらのLNPは、in vitro でHepG2細胞で、in vivo でC57BL/6マウスでその効力を試験しました。
Abstract
脂質ナノ粒子(LNP)は、モデルナ社とファイザー/ビオンテック社によるCOVID-19 mRNAワクチンの開発に成功したことで、最近広く注目を集めています。これらのワクチンは、mRNA-LNP治療薬の有効性を実証し、将来の臨床応用への扉を開きました。mRNA-LNPシステムでは、LNPはmRNAカーゴをヌクレアーゼによる分解から保護し、細胞内送達を媒介する送達プラットフォームとして機能します。LNPは通常、イオン化脂質、リン脂質、コレステロール、脂質アンカー型ポリエチレングリコール(PEG)複合体(脂質-PEG)の4つの成分で構成されています。ここで、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAを内包したLNPは、LNP脂質成分を含む有機相とmRNAを含む水相をマイクロ流体混合することにより製剤化される。次に、これらのmRNA-LNPをin vitroで試験し、生物発光プレートベースのアッセイを用いてHepG2細胞におけるトランスフェクション効率を評価します。さらに、mRNA-LNPは、外側尾静脈からの静脈内注射後のC57BL/6マウスのin vivoで評価されます。全身生物発光イメージングは、in vivoイメージングシステムを用いて行われる。代表的な結果として、mRNA-LNPの特性、HepG2細胞におけるトランスフェクション効率、およびC57BL/6マウスにおける全発光束が示されています。
Introduction
脂質ナノ粒子(LNP)は、近年、非ウイルス性遺伝子治療の分野で大きな期待が寄せられています。2018年、米国食品医薬品局(FDA)は、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシス1,2,3,4の治療薬として、史上初のRNA干渉(RNAi)治療薬であるOnpattro by Alnylamを承認しました。これは、脂質ナノ粒子とRNAベースの治療にとって重要な一歩でした。最近では、モデルナとファイザー/ビオンテックがSARS-CoV-2に対するmRNA-LNPワクチンのFDA承認を取得しました4,5。これらのLNPベースの核酸療法のそれぞれにおいて、LNPはヌクレアーゼによる分解から貨物を保護し、強力な細胞内送達を促進する役割を果たします6,7。LNPはRNAi療法やワクチンへの応用で成功を収めていますが、mRNA-LNPは、タンパク質補充療法8や、Cas9 mRNAとガイドRNAの同時送達、遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9システムの送達9なども検討されています。しかし、すべての用途に適した特定の製剤はなく、LNP製剤パラメータの微妙な変化は、in vivoでの効力と生体内分布に大きな影響を与える可能性があります8,10,11。したがって、個々のmRNA-LNPを開発および評価して、各LNPベースの治療法に最適な製剤を決定する必要があります。
LNPは一般的に、イオン化脂質、リン脂質、コレステロール、脂質アンカー型ポリエチレングリコール(PEG)複合体(脂質-PEG)の4つの脂質成分で配合されています11,12,13。LNPによって促進される強力な細胞内送達は、部分的には、イオン化脂質成分12に依存している。この成分は、生理的pHでは中性であるが、エンドソーム11の酸性環境では正に帯電する。このイオン電荷の変化は、エンドソーム脱出の主な原因であると考えられている12,14,15。イオン化脂質に加えて、リン脂質(ヘルパー脂質)成分はカーゴのカプセル化を改善し、エンドソーム脱出を助け、コレステロールは安定性を提供し、膜融合を促進し、脂質-PEGは循環中のLNP凝集とオプソニン化を最小限に抑えます10,11,14,16.LNPを調合するには、これらの脂質成分を有機相(典型的にはエタノール)に結合し、核酸カーゴを含む水相と混合する。LNP製剤プロセスは、多数の物理化学的特性を持つ多くのLNP製剤を製剤化するために、さまざまな成分を簡単に置換してさまざまなモル比で組み合わせることができるという点で非常に用途が広い10,17。しかし、この多種多様なLNPを探索する際には、特性評価と性能の違いを正確に測定するために、標準化された手順を使用して各配合を評価することが重要です。
ここでは、mRNA-LNPの調製と、細胞および動物におけるmRNA-LNPの性能評価のための完全なワークフローについて概説します。
Protocol
注:mRNA-LNPを調製する際には、RNaseおよびDNAの表面除染剤で表面および装置を拭き取り、常にRNaseフリーの状態を維持してください。RNaseフリーのチップと試薬のみを使用してください。 すべての動物実験は、ペンシルベニア大学の実験動物のケアと使用に関するガイドラインと、ペンシルベニア大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従って行われま?…
Representative Results
mRNA-LNPは、平均流体力学的直径76.16 nm、多分散度指数0.098のマイクロ流体装置を用いて調製しました。mRNA−LNPのpKaは 、TNSアッセイを行うことにより5.75であることがわかった18。これらのmRNA-LNPのカプセル化効率は、修飾蛍光アッセイおよび 式4.4を用いて92.3%と計算した。細胞処理および動物投与に使用した全 RNA 濃度は 40.24 ng/μL でした。この値は?…
Discussion
このワークフローでは、さまざまなmRNA-LNPを調製し、in vitroおよびin vivoでの効率を試験することができます。イオン化可能な脂質と賦形剤は、異なるモル比および異なるイオン化可能な脂質とmRNAの重量比で交換し、組み合わせることで、異なる物理化学的特性を持つmRNA-LNPを生成することができる22。ここでは、モル比35/16/46.5/2.5(イオン化脂質:ヘルパー脂質:コ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M.は、米国国立衛生研究所(NIH)所長のニューイノベーター賞(DP2 TR002776)、科学インターフェース(CASI)のバロウズウェルカム基金キャリア賞、米国国立科学財団のキャリア賞(CBET-2145491)、および米国国立衛生研究所(NCI R01 CA241661、NCI R37 CA244911、およびNIDDK R01 DK123049)からの追加資金からの支援に感謝します。
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
Cite This Article
El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing. J. Vis. Exp. (191), e64810, doi:10.3791/64810 (2023).