Testando a Eficiência In Vitro e In Vivo de Nanopartículas de RNAm-Lipídios Formuladas por Mistura Microfluídica
Summary
Aqui, um protocolo para a formulação de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulam RNAm que codifica a luciferase do vagalume é apresentado. Esses LNPs foram testados quanto à sua potência in vitro em células HepG2 e in vivo em camundongos C57BL/6.
Abstract
As nanopartículas lipídicas (LNPs) atraíram atenção generalizada recentemente com o desenvolvimento bem-sucedido das vacinas de mRNA COVID-19 pela Moderna e Pfizer/BioNTech. Essas vacinas demonstraram a eficácia da terapêutica mRNA-LNP e abriram as portas para futuras aplicações clínicas. Em sistemas de mRNA-LNP, os LNPs servem como plataformas de entrega que protegem a carga de mRNA da degradação por nucleases e mediam sua entrega intracelular. Os LNPs são tipicamente compostos por quatro componentes: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG). Aqui, LNPs encapsulando mRNA que codificam a luciferase de vagalumes são formulados por mistura microfluídica da fase orgânica contendo componentes lipídicos do LNP e da fase aquosa contendo mRNA. Esses mRNA-LNPs são então testados in vitro para avaliar sua eficiência de transfecção em células HepG2 usando um ensaio baseado em placa bioluminescente. Além disso, os mRNA-LNPs são avaliados in vivo em camundongos C57BL/6 após uma injeção intravenosa através da veia lateral da cauda. A imagem de bioluminescência de corpo inteiro é realizada usando um sistema de imagem in vivo . Resultados representativos são mostrados para as características do RNAm-LNP, sua eficiência de transfecção em células HepG2 e o fluxo luminescente total em camundongos C57BL/6.
Introduction
Nanopartículas lipídicas (LNPs) têm se mostrado promissoras nos últimos anos no campo da terapia gênica não viral. Em 2018, a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos aprovou a primeira terapêutica de RNA de interferência (RNAi), Onpattro by Alnylam, para o tratamento da amiloidose transtirretina hereditária 1,2,3,4. Este foi um passo importante para nanopartículas lipídicas e terapias baseadas em RNA. Mais recentemente, a Moderna e a Pfizer/BioNTech receberam aprovações da FDA para suas vacinas de mRNA-LNP contra o SARS-CoV-2 4,5. Em cada uma dessas terapias de ácidos nucleicos baseadas em LNP, o LNP serve para proteger sua carga da degradação por nucleases e facilitar a potente liberação intracelular 6,7. Enquanto LNPs têm visto sucesso em terapias de RNAi e aplicações de vacinas, mRNA-LNPs também têm sido explorados para uso em terapias de substituição de proteínas8, bem como para a co-entrega de mRNA Cas9 e RNA guia para a entrega do sistema CRISPR-Cas9 para edição de genes9. No entanto, não há uma formulação específica que seja adequada para todas as aplicações, e mudanças sutis nos parâmetros de formulação do LNP podem afetar sobremaneira a potência e a biodistribuição in vivo 8,10,11. Assim, RNAm-LNPs individuais devem ser desenvolvidos e avaliados para determinar a formulação ideal para cada terapia baseada em LNP.
Os LNPs são comumente formulados com quatro componentes lipídicos: um lipídio ionizável, um fosfolipídio, colesterol e um conjugado de polietilenoglicol (PEG) ancorado a lipídios (lipid-PEG)11,12,13. A potente liberação intracelular facilitada pelos LNPs reside, em parte, no componente lipídico ionizável12. Esse componente é neutro em pH fisiológico, mas torna-se carregado positivamente no ambiente ácido do endossomo11. Acredita-se que essa mudança na carga iônica seja um dos principais contribuintes para o escape endossômico12,14,15. Além do lipídio ionizável, o componente fosfolipídeo (lipídio auxiliar) melhora a encapsulação da carga e auxilia no escape endossomal, o colesterol oferece estabilidade e aumenta a fusão da membrana, e o lipídio-PEG minimiza a agregação e opsonização do LNP na circulação10,11,14,16. Para formular o LNP, esses componentes lipídicos são combinados em uma fase orgânica, tipicamente etanol, e misturados com uma fase aquosa contendo a carga de ácido nucleico. O processo de formulação do LNP é muito versátil, pois permite que diferentes componentes sejam facilmente substituídos e combinados em diferentes razões molares para formular muitas formulações de LNP com uma infinidade de propriedades físico-químicas10,17. No entanto, ao explorar essa grande variedade de LNPs, é crucial que cada formulação seja avaliada usando um procedimento padronizado para medir com precisão as diferenças na caracterização e desempenho.
Aqui, o fluxo de trabalho completo para a formulação de mRNA-LNPs e a avaliação de seu desempenho em células e animais é descrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com esse fluxo de trabalho, uma variedade de mRNA-LNPs pode ser formulada e testada quanto à sua eficiência in vitro e in vivo. Lipídios ionizáveis e excipientes podem ser trocados e combinados em diferentes razões molares e diferentes razões de peso de lipídios ionizáveis para RNAm para produzir RNAm-LNPs com diferentes propriedades físico-químicas22. Aqui, formulamos C12-200 mRNA-LNPs com uma razão molar de 35/16/46,5/2,5 (lipídio ionizável:lipídio auxiliar:colest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. reconhece o apoio de um Prêmio Novo Inovador do Diretor do National Institutes of Health (NIH) dos EUA (DP2 TR002776), um Prêmio de Carreira do Fundo Burroughs Wellcome na Interface Científica (CASI), um prêmio CAREER da Fundação Nacional de Ciência dos EUA (CBET-2145491) e financiamento adicional dos Institutos Nacionais de Saúde (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 e NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
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