Тестирование эффективности in vitro и in vivo мРНК-липидных наночастиц, полученных путем микрофлюидного смешивания
Summary
Представлен протокол разработки липидных наночастиц (ЛНЧ), инкапсулирующих мРНК, кодирующую люциферазу светлячка. Эти LNP были протестированы на их активность in vitro в клетках HepG2 и in vivo на мышах C57BL/6.
Abstract
Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последнее время привлекли широкое внимание в связи с успешной разработкой мРНК-вакцин против COVID-19 компаниями Moderna и Pfizer/BioNTech. Эти вакцины продемонстрировали эффективность терапии на основе мРНК-ЛЯП и открыли двери для будущих клинических применений. В системах мРНК-ЛЯП ЛЯП служат платформами доставки, которые защищают груз мРНК от деградации нуклеазами и опосредуют их внутриклеточную доставку. LNP обычно состоят из четырех компонентов: ионизируемого липида, фосфолипида, холестерина и конъюгата полиэтиленгликоля (ПЭГ) с липидной привязкой (липид-ПЭГ). Здесь ЛЯП, инкапсулирующие мРНК, кодирующую люциферазу светлячка, образуются путем микрофлюидного смешивания органической фазы, содержащей липидные компоненты LNP, и водной фазы, содержащей мРНК. Затем эти мРНК-ЛНЧ тестируются in vitro для оценки эффективности их трансфекции в клетках HepG2 с помощью анализа на основе биолюминесцентной пластины. Кроме того, мРНК-LNP оценивают in vivo у мышей C57BL/6 после внутривенной инъекции через боковую хвостовую вену. Биолюминесцентная визуализация всего тела выполняется с помощью системы визуализации in vivo . Приведены репрезентативные результаты для характеристик мРНК-ЛЯП, эффективности их трансфекции в клетках HepG2 и общего люминесцентного потока у мышей линии C57BL/6.
Introduction
Липидные наночастицы (ЛНЧ) в последние годы продемонстрировали большие перспективы в области невирусной генной терапии. В 2018 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первый в мире препарат для лечения наследственного транстиретинового амилоидоза 1,2,3,4 на основе РНК-интерференции (РНК-интерференции) Onpattro от Alnylam. Это был важный шаг вперед для липидных наночастиц и терапии на основе РНК. Совсем недавно компании Moderna и Pfizer/BioNTech получили одобрение FDA на свои вакцины мРНК-LNP против SARS-CoV-2 4,5. В каждой из этих терапий на основе ЛЯП нуклеиновых кислот ЛЯП служит для защиты груза от деградации нуклеазами и облегчения мощной внутриклеточной доставки 6,7. В то время как LNP успешно применяются в РНК-интерференционной терапии и применении вакцин, мРНК-LNP также были исследованы для использования в белковозаместительной терапии8, а также для совместной доставки мРНК Cas9 и направляющей РНК для доставки системы CRISPR-Cas9 для редактирования генов9. Тем не менее, не существует какой-то одной конкретной формулы, которая хорошо подходила бы для всех применений, и незначительные изменения в параметрах рецептуры LNP могут сильно повлиять на эффективность и биораспределение in vivo 8,10,11. Таким образом, для определения оптимальной рецептуры для каждой терапии на основе ЛНЧ необходимо разработать и оценить отдельные мРНК-ЛНЧ.
В состав LNP обычно входят четыре липидных компонента: ионизируемый липид, фосфолипид, холестерин и липидно-закрепленный конъюгат полиэтиленгликоля (ПЭГ) (липид-ПЭГ)11,12,13. Мощная внутриклеточная доставка, обеспечиваемая ЛНЧ, частично зависит от ионизируемого липидного компонента12. Этот компонент нейтрален при физиологическом рН, но становится положительно заряженным в кислой среде эндосомы11. Считается, что это изменение ионного заряда является ключевым фактором эндосомального побега12,14,15. В дополнение к ионизируемому липиду, фосфолипидный компонент (липид-хелпер) улучшает инкапсуляцию груза и способствует эндосомальному побегу, холестерин обеспечивает стабильность и усиливает слияние мембран, а липид-ПЭГ сводит к минимуму агрегацию и опсонизацию LNP в кровотоке10,11,14,16. Для создания LNP эти липидные компоненты объединяются в органическую фазу, как правило, этанол, и смешиваются с водной фазой, содержащей груз нуклеиновых кислот. Процесс разработки LNP очень универсален в том смысле, что он позволяет легко заменять и комбинировать различные компоненты при различных молярных соотношениях для создания множества рецептур LNP с множеством физико-химических свойств10,17. Тем не менее, при изучении этого огромного разнообразия LNP крайне важно, чтобы каждая рецептура оценивалась с использованием стандартизированной процедуры для точного измерения различий в характеристиках и эксплуатационных характеристиках.
В этой статье описывается полный рабочий процесс по составлению мРНК-ЛНЧ и оценке их эффективности в клетках и на животных.
Protocol
Representative Results
Discussion
С помощью этого рабочего процесса можно сформулировать и протестировать различные мРНК-ЛЯП на предмет их эффективности in vitro и in vivo. Ионизируемые липиды и вспомогательные вещества могут быть заменены и комбинированы при различных молярных соотношениях и различном массовом с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. выражает признательность за поддержку со стороны премии директора Национального института здравоохранения США (NIH) «Новый новатор» (DP2 TR002776), премии Burroughs Wellcome Fund Career Award в Scientific Interface (CASI), премии CAREER Национального научного фонда США (CBET-2145491) и дополнительного финансирования от Национальных институтов здравоохранения (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 и NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
