여기에서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(LNP)를 제형화하기 위한 프로토콜이 제시된다. 이 LNP는 HepG2 세포의 in vitro 및 C57BL/6 마우스의 in vivo 에서 효능을 테스트했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
지질 나노입자(LNP)는 최근 모더나와 화이자/바이오엔테크의 코로나19 mRNA 백신 개발에 성공하면서 주목을 받고 있다. 이 백신은 mRNA-LNP 치료제의 효능을 입증하고 향후 임상 적용의 문을 열었습니다. mRNA-LNP 시스템에서 LNP는 뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA 화물을 보호하고 세포 내 전달을 매개하는 전달 플랫폼 역할을 합니다. LNP는 일반적으로 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합체(지질-PEG)의 네 가지 구성 요소로 구성됩니다. 여기서, 반딧불이 루시페라아제를 인코딩하는 mRNA를 캡슐화하는 LNP는 LNP 지질 성분을 함유하는 유기상과 mRNA를 함유하는 수성상의 미세유체 혼합에 의해 제형화된다. 그런 다음 이러한 mRNA-LNP를 체외에서 테스트하여 생물 발광 플레이트 기반 분석을 사용하여 HepG2 세포에서 transfection 효율을 평가합니다. 또한 mRNA-LNP는 측면 꼬리 정맥을 통한 정맥 주입 후 C57BL/6 마우스에서 in vivo로 평가됩니다. 전신 생물 발광 이미징은 in vivo 이미징 시스템을 사용하여 수행됩니다. 대표적인 결과는 mRNA-LNP 특성, HepG2 세포에서의 transfection 효율 및 C57BL/6 마우스의 총 발광 플럭스에 대한 것입니다.
서론
지질 나노입자(LNP)는 최근 몇 년 동안 비바이러스 유전자 치료 분야에서 큰 가능성을 보여주었습니다. 2018년 미국 식품의약국(FDA)은 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증 1,2,3,4 치료를 위해 최초의 RNA 간섭(RNAi) 치료제인 Onpattro by Alnylam을 승인했습니다. 이는 지질 나노입자 및 RNA 기반 치료법의 중요한 진전이었습니다. 최근에는 Moderna와 Pfizer/BioNTech가 SARS-CoV-2 4,5에 대한 mRNA-LNP 백신에 대한 FDA 승인을 받았습니다. 이러한 각각의 LNP 기반 핵산 치료제에서 LNP는 뉴클레아제에 의한 분해로부터 화물을 보호하고 강력한 세포 내 전달을 촉진하는 역할을 합니다 6,7. LNP는 RNAi 치료제 및 백신 응용 분야에서 성공을 거두었으며, mRNA-LNP는 단백질 대체 요법8과 유전....
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프로토콜
참고: RNase 및 DNA에 대한 표면 오염 제거제로 표면과 장비를 닦아 mRNA-LNP를 제형화할 때 항상 RNase가 없는 상태를 유지하십시오. RNase가 없는 팁과 시약만 사용하십시오.
모든 동물 시술은 펜실베니아 대학의 실험 동물 관리 및 사용 지침과 펜실베니아 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 사전 제형 준비
- 깨끗한 4L 비커에 200-300mL의 신선한 10x 인산염 완충 식염수(PBS)를 채웁니다.
- 비커의 10x PBS를 초순수로 10배 희석하여 1x PBS의 비커를 얻습니다. 1x PBS의 최종 부피가 2-3L 사이인지 확인하십시오.
- LNP 제형에 적합한 용량의 투석 카세트(20kDa 분자량 컷오프[MWCO])를 채워진 비커에 넣어 수화합니다.
알림: 투석 카세트는 사용하기 전에 수분을 공급하는 데 최소 2분이 필요합니다. - 비커에 교반 막대를 놓고 알루미늄 호일로 비커를 덮습니다.
- 덮개가 있는 비커를 자석 교반 접시에 놓습니다. 교반 플레이트....
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결과
mRNA-LNP는 평균 유체역학적 직경이 76.16nm이고 다분산성 지수가 0.098인 미세유체 기기를 사용하여 제형화되었습니다. mRNA-LNP의pKa는 TNS 분석(18)을 수행하여 5.75로 확인되었다. 이러한 mRNA-LNP에 대한 캡슐화 효율은 수정된 형광 분석 및 방정식 4.4를 사용하여 92.3%로 계산되었습니다. 세포 처리 및 동물 투여에 사용된 전체 RNA 농도는 40.24ng/μL였습니다. 이 값은 변형된 형광 분석법(19)으로부터, 특히 LNP를 1% Triton X-100 및1x TE 완충액으로 희석하여 얻은 형광을 특정 농도로 변환하고 캡슐화된 mRNA의 양을 계산하여 얻은 것이다.
방정식 4.4
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토론
이 워크플로우를 통해 다양한 mRNA-LNP를 제형화하고 in vitro 및 in vivo 효율을 테스트할 수 있습니다. 이온화 가능한 지질과 부형제는 서로 다른 몰비 및 서로 다른 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량비로 스왑 및 결합하여 서로 다른 물리화학적 특성을 가진 mRNA-LNP를 생성할 수 있습니다22. 여기서는 10:1 이온화 가능한 지질 대 mRNA 중량비에서 35/16/46.5/2.5(이온화 가능한 지질:도우미 지질:콜레스테롤:지질-PEG)의 몰비로 C12-200 mRNA-LNP를 제형화했습니다. 이 LNP는 HepG2 세포의 in vitro 및 C57BL/6 마우스의 in vivo에서 형질주입 효율을 테스트했습니다. C12-200 mRNA-LNP는 상업적으로 이용 가능한 미세유체 기기를 사용하여 미세유체 혼합에 의해 합성되었습니다. 피펫 혼합 또는 T-접합 혼합4과 같은 다른 제형 방법이 LNP를 제형화.......
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공개 사항
신고할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
M.J.M.은 미국 국립보건원(NIH) Director's New Innovator Award(DP2 TR002776), Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface(CASI), US National Science Foundation CAREER Award(CBET-2145491) 및 National Institutes of Health(NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 및 NIDDK R01 DK123049)의 추가 자금 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.1 M 염산 | 시그마 | 7647-01-0 | |
| 0.22 μ m 주사기 필터 | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD 슬립 팁 주사기 | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf 튜브 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15mL 원뿔형 튜브 | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 프루프 에탄올 | Decon Labs | 2716 | |
| 23G 바늘 | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3mL BD 일회용 주사기(Luer-Lok 팁 포함 | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3mL 투석 카세트 | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 웰 블랙 월 블랙 바닥 플레이트 | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 웰 화이트/클리어 바닥 플레이트, TC 표면 | Thermo Scientific | 165306 | |
| 암모늄 아세테이트, 1 킬로그램 | 연구 제품 국제 | 631-61-8 | |
| 암모늄 구연산염 이염기성 | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok 주사기 멸균, 일회용, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 이온화 지질 | 케이맨 화학 물질 | 36699 | |
| C57BL/6 마우스 | 잭슨 실험실 | 000664 | |
| 콜레스테롤 | 시그마 | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| 일회용 큐벳 | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, 고포도 | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel 인슐린 주사기 - 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| 소 태아 혈청 | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure 분자 생물학 등급 Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| 인피니트 200 PRO 플레이트 리더 | Tecan | N/A | |
| IVIS 스펙트럼 생체 내 이미징 시스템 | Perkin Elmer | N/A | |
| 대형 Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase 분석 키트 | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite 카트리지 - 클래식 - 100 | 정밀 나노시스템 | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite 기기 | 정밀 나노시스템 | NIN0001 | |
| PBS - 인산염 완충 식염수(10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB 구연산염 완충액, (구연산염 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA 분석 키트 | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| 염화나트륨 | 시그마 | 7647-14-5 | |
| 수산화나트륨 | 시그마 | 1310-73-2 | |
| 인산나트륨 | 시그마 | 7601-54-9 | |
| TNS 시약(6-(p-톨루이디노)-2-나프탈렌술폰산나트륨염) | 시그마 | T9792 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | 9036-19-5 | |
| 제타사이저 | 말번 파날리티칼 | 나노ZS |
참고문헌
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran ....
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재인쇄 및 허가
