Prueba de la eficiencia in vitro e in vivo de nanopartículas lipídicas de ARNm formuladas mediante mezcla microfluídica
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para la formulación de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga. La potencia de estos LNP se probó in vitro en células HepG2 e in vivo en ratones C57BL/6.
Abstract
Las nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés) han atraído una amplia atención recientemente con el exitoso desarrollo de las vacunas de ARNm contra la COVID-19 por parte de Moderna y Pfizer/BioNTech. Estas vacunas han demostrado la eficacia de las terapias de ARNm-LNP y han abierto la puerta a futuras aplicaciones clínicas. En los sistemas ARNm-LNP, los LNP sirven como plataformas de administración que protegen la carga de ARNm de la degradación por nucleasas y median su entrega intracelular. Los LNP suelen estar compuestos por cuatro componentes: un lípido ionizable, un fosfolípido, colesterol y un conjugado de polietilenglicol (PEG) anclado a lípidos (lípido-PEG). En este caso, los LNP que encapsulan el ARNm que codifica la luciferasa de luciérnaga se formulan mediante la mezcla microfluídica de la fase orgánica que contiene los componentes lipídicos de LNP y la fase acuosa que contiene el ARNm. A continuación, estos ARNm-LNP se prueban in vitro para evaluar su eficacia de transfección en células HepG2 mediante un ensayo bioluminiscente basado en placas. Además, los ARNm-LNP se evalúan in vivo en ratones C57BL/6 después de una inyección intravenosa a través de la vena lateral de la cola. Las imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero se realizan mediante el uso de un sistema de imágenes in vivo . Se muestran resultados representativos de las características de ARNm-LNP, su eficiencia de transfección en células HepG2 y el flujo luminiscente total en ratones C57BL/6.
Introduction
Las nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado ser muy prometedoras en los últimos años en el campo de la terapia génica no viral. En 2018, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) aprobó la primera terapia de ARN de interferencia (ARNi), Onpattro de Alnylam, para el tratamiento de la amiloidosis hereditaria por transtiretina 1,2,3,4. Este fue un importante paso adelante para las nanopartículas lipídicas y las terapias basadas en ARN. Más recientemente, Moderna y Pfizer/BioNTech recibieron la aprobación de la FDA para sus vacunas de ARNm-LNP contra el SARS-CoV-2 4,5. En cada una de estas terapias de ácidos nucleicos basadas en LNP, la LNP sirve para proteger su carga de la degradación por las nucleasas y facilitar una potente administración intracelular 6,7. Si bien las LNP han tenido éxito en las terapias de ARNi y en las aplicaciones de vacunas, también se han explorado las LNP de ARNm para su uso en terapias de reemplazo de proteínas8, así como para la administración conjunta de ARNm Cas9 y ARN guía para la administración del sistema CRISPR-Cas9 para la edición de genes9. Sin embargo, no existe una formulación específica que sea adecuada para todas las aplicaciones, y los cambios sutiles en los parámetros de formulación de LNP pueden afectar en gran medida la potencia y la biodistribución in vivo 8,10,11. Por lo tanto, se deben desarrollar y evaluar ARNm individuales para determinar la formulación óptima para cada terapia basada en LNP.
Los LNP se formulan comúnmente con cuatro componentes lipídicos: un lípido ionizable, un fosfolípido, colesterol y un conjugado de polietilenglicol (PEG) anclado a lípidos (lípido-PEG)11,12,13. La potente administración intracelular facilitada por las LNP depende, en parte, del componente lipídico ionizable12. Este componente es neutro a pH fisiológico, pero se carga positivamente en el ambiente ácido del endosoma11. Se cree que este cambio en la carga iónica es un factor clave que contribuye al escape endosomal12,14,15. Además del lípido ionizable, el componente fosfolípido (lípido auxiliar) mejora la encapsulación de la carga y ayuda en el escape endosomal, el colesterol ofrece estabilidad y mejora la fusión de la membrana, y el lípido-PEG minimiza la agregación y opsonización de LNP en circulación10,11,14,16. Para formular el LNP, estos componentes lipídicos se combinan en una fase orgánica, típicamente etanol, y se mezclan con una fase acuosa que contiene la carga de ácido nucleico. El proceso de formulación de LNP es muy versátil, ya que permite sustituir y combinar fácilmente diferentes componentes en diferentes proporciones molares para formular muchas formulaciones de LNP con multitud de propiedades fisicoquímicas10,17. Sin embargo, al explorar esta gran variedad de LNP, es crucial que cada formulación se evalúe utilizando un procedimiento estandarizado para medir con precisión las diferencias en la caracterización y el rendimiento.
Aquí, se describe el flujo de trabajo completo para la formulación de ARNm-LNP y la evaluación de su rendimiento en células y animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con este flujo de trabajo, se puede formular y probar una variedad de ARNm-LNP para determinar su eficiencia in vitro e in vivo. Los lípidos y excipientes ionizables pueden intercambiarse y combinarse en diferentes proporciones molares y diferentes proporciones de lípidos ionizables a peso de ARNm para producir ARNm-LNP con diferentes propiedades fisicoquímicas22. Aquí, formulamos C12-200 ARNm-LNP con una relación molar de 35/16/46,5/2,5 (lípido ionizable: lípido auxiliar:…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. agradece el apoyo de un Premio al Nuevo Innovador del Director de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) de los Estados Unidos (DP2 TR002776), un Premio a la Carrera del Fondo Burroughs Wellcome en la Interfaz Científica (CASI), un premio a la Carrera de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (CBET-2145491) y fondos adicionales de los Institutos Nacionales de la Salud (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 y NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
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