Testning av in vitro - och in vivo-effektiviteten hos mRNA-lipidnanopartiklar formulerade genom mikrofluidisk blandning
Summary
Här presenteras ett protokoll för att formulera lipidnanopartiklar (LNP) som kapslar in mRNA som kodar för eldflugeluciferas. Dessa LNP:er testades för sin styrka in vitro i HepG2-celler och in vivo i C57BL/6-möss.
Abstract
Lipidnanopartiklar (LNP) har väckt stor uppmärksamhet på senare tid i och med den framgångsrika utvecklingen av mRNA-vaccinerna mot covid-19 av Moderna och Pfizer/BioNTech. Dessa vacciner har visat effekten av mRNA-LNP-terapier och öppnat dörren för framtida kliniska tillämpningar. I mRNA-LNP-system fungerar LNP:erna som leveransplattformar som skyddar mRNA-lasten från nedbrytning av nukleaser och förmedlar deras intracellulära leverans. LNP:erna består vanligtvis av fyra komponenter: en joniserbar lipid, en fosfolipid, kolesterol och ett lipidförankrat polyetylenglykolkonjugat (PEG) (lipid-PEG). Här formuleras LNP:er som kapslar in mRNA-kodande eldflugeluciferas genom mikrofluidisk blandning av den organiska fasen som innehåller LNP-lipidkomponenter och den vattenhaltiga fasen som innehåller mRNA. Dessa mRNA-LNP:er testas sedan in vitro för att utvärdera deras transfektionseffektivitet i HepG2-celler med hjälp av en bioluminescerande plattbaserad analys. Dessutom utvärderas mRNA-LNPs in vivo i C57BL/6-möss efter en intravenös injektion via den laterala svansvenen. Helkroppsbioluminiscensavbildning utförs med hjälp av ett in vivo-avbildningssystem . Representativa resultat visas för mRNA-LNP-egenskaperna, deras transfektionseffektivitet i HepG2-celler och det totala luminescerande flödet i C57BL/6-möss.
Introduction
Lipidnanopartiklar (LNP) har visat sig vara mycket lovande under de senaste åren inom området icke-viral genterapi. År 2018 godkände USA:s Food and Drug Administration (FDA) den första RNA-interferensterapin (RNAi) någonsin, Onpattro by Alnylam, för behandling av ärftlig transtyretinamyloidos 1,2,3,4. Detta var ett viktigt steg framåt för lipidnanopartiklar och RNA-baserade terapier. Nyligen fick Moderna och Pfizer/BioNTech FDA-godkännanden för sina mRNA-LNP-vacciner mot SARS-CoV-2 4,5. I var och en av dessa LNP-baserade nukleinsyraterapier tjänar LNP till att skydda sin last från nedbrytning av nukleaser och underlätta potent intracellulär leverans 6,7. Medan LNP:er har haft framgång inom RNAi-terapier och vaccintillämpningar, har mRNA-LNP:er också undersökts för användning i proteinersättningsterapier8 samt för samleverans av Cas9-mRNA och guide-RNA för leverans av CRISPR-Cas9-systemet för genredigering9. Det finns dock ingen specifik formulering som är väl lämpad för alla applikationer, och subtila förändringar i LNP-formuleringsparametrarna kan i hög grad påverka styrkan och biodistributionen in vivo 8,10,11. Därför måste enskilda mRNA-LNP:er utvecklas och utvärderas för att bestämma den optimala formuleringen för varje LNP-baserad terapi.
LNP formuleras vanligen med fyra lipidkomponenter: en joniserbar lipid, en fosfolipid, kolesterol och ett lipidförankrat polyetylenglykolkonjugat (PEG) (lipid-PEG)11,12,13. Den potenta intracellulära tillförseln som underlättas av LNP är delvis beroende av den joniserbara lipidkomponenten12. Denna komponent är neutral vid fysiologiskt pH men blir positivt laddad i den sura miljön i endosom11. Denna förändring i jonisk laddning tros vara en viktig bidragande orsak till endosomal flykt12,14,15. Förutom den joniserbara lipiden förbättrar fosfolipidkomponenten (hjälplipid) inkapslingen av lasten och hjälper till med endosomal flykt, kolesterolet erbjuder stabilitet och förbättrar membranfusionen, och lipid-PEG minimerar LNP-aggregering och opsonisering i cirkulationen10,11,14,16. För att formulera LNP kombineras dessa lipidkomponenter i en organisk fas, vanligtvis etanol, och blandas med en vattenfas som innehåller nukleinsyralasten. LNP-formuleringsprocessen är mycket mångsidig genom att den gör det möjligt att enkelt substituera och kombinera olika komponenter vid olika molförhållanden för att formulera många LNP-formuleringar med en mängd fysikalisk-kemiska egenskaper10,17. Men när man utforskar detta stora utbud av LNP:er är det avgörande att varje formulering utvärderas med hjälp av en standardiserad procedur för att noggrant mäta skillnaderna i karakterisering och prestanda.
Här beskrivs det fullständiga arbetsflödet för formulering av mRNA-LNP:er och bedömningen av deras prestanda i celler och djur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med detta arbetsflöde kan en mängd olika mRNA-LNP:er formuleras och testas för deras effektivitet in vitro och in vivo. Joniserbara lipider och hjälpämnen kan bytas ut och kombineras vid olika molarförhållanden och olika viktförhållanden mellan joniserbara lipider och mRNA för att producera mRNA-LNP med olika fysikalisk-kemiska egenskaper22. Här formulerade vi C12-200 mRNA-LNPs med ett molarförhållande på 35/16/46,5/2,5 (joniserbar lipid:hjälparlipid:kolesterol:lip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.J.M. erkänner stöd från en US National Institutes of Health (NIH) Director’s New Innovator Award (DP2 TR002776), en Burroughs Wellcome Fund Career Award vid Scientific Interface (CASI), en US National Science Foundation CAREER-utmärkelse (CBET-2145491) och ytterligare finansiering från National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 och NIDDK R01 DK123049).
Materials
| 0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
| Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
| Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
| RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
References
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran to treat hereditary transthyretin amyloidosis. Nature Reviews Neurology. 14 (9), 509 (2018).
- Zhang, X., Goel, V., Robbie, G. J. Pharmacokinetics of patisiran, the first approved RNA interference therapy in patients With hereditary transthyretin-mediated amyloidosis. Journal of Clinical Pharmacology. 60 (5), 573-585 (2019).
- Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Letters. 21 (13), 5671-5680 (2021).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mukalel, A. J., Riley, R. S., Zhang, R., Mitchell, M. J. Nanoparticles for nucleic acid delivery: Applications in cancer immunotherapy. Cancer Letters. 458, 102-112 (2019).
- Akhtar, S. Oral delivery of siRNA and antisense oligonucleotides. Journal of Drug Targeting. 17 (7), 491-495 (2009).
- Guimaraes, P. P. G., et al. Ionizable lipid nanoparticles encapsulating barcoded mRNA for accelerated in vivo delivery screening. Journal of Controlled Release. 316, 404-417 (2019).
- Qiu, M., et al. Lipid nanoparticle-mediated codelivery of Cas9 mRNA and single-guide RNA achieves liver-specific in vivo genome editing of Angptl3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (10), 2020401118 (2021).
- Zhang, R., et al. Helper lipid structure influences protein adsorption and delivery of lipid nanoparticles to spleen and liver. Biomaterials Science. 9 (4), 1449-1463 (2021).
- El-Mayta, R., et al. A nanoparticle platform for accelerated in vivo oral delivery screening of nucleic acids. Advanced Therapeutics. 4 (1), 2000111 (2021).
- Patel, S., et al. Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles induce polymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA. Nature Communications. 11, 983 (2020).
- Kulkarni, J. A., et al. Design of lipid nanoparticles for in vitro and in vivo delivery of plasmid DNA. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (4), 1377-1387 (2017).
- Cheng, X., Lee, R. J. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 99, 129-137 (2016).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151 (3), 220-228 (2011).
- Granot, Y., Peer, D. Delivering the right message: Challenges and opportunities in lipid nanoparticles-mediated modified mRNA therapeutics-An innate immune system standpoint. Seminars in Immunology. 34, 68-77 (2017).
- Gan, Z., et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (3), 10161 (2020).
- Patel, S. K., et al. Hydroxycholesterol substitution in ionizable lipid nanoparticles for mRNA delivery to T cells. Journal of Controlled Release. 347, 521-532 (2022).
- Robinson, E., et al. Lipid nanoparticle-delivered chemically modified mRNA restores chloride secretion in cystic fibrosis. Molecular Therapy. 26 (8), 2034-2046 (2018).
- Love, K. T., et al. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 1864-1869 (2010).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Billingsley, M. M., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Letters. 20 (3), 1578-1589 (2020).
- Ramaswamy, S., et al. Systemic delivery of factor IX messenger RNA for protein replacement therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1941-1950 (2017).
- Leung, A. K. K., et al. Lipid nanoparticles containing siRNA synthesized by microfluidic mixing exhibit an electron-dense nanostructured core. Journal of Physical Chemistry C. 116 (34), 18440-18450 (2012).
- Billingsley, M. M., et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Letters. 22 (1), 533-542 (2022).
- Khalil, A. A., et al. Subcutaneous administration of D-luciferin is an effective alternative to intraperitoneal injection in bioluminescence imaging of xenograft tumors in nude mice. ISRN Molecular Imaging. 2013, 689279 (2013).
- Qin, J., et al. RGD peptide-based lipids for targeted mRNA delivery and gene editing applications. RSC Advances. 12 (39), 25397-25404 (2022).
- Pardi, N., et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. Journal of Controlled Release. 217, 345-351 (2015).
- Finn, J. D., et al. A single administration of CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles achieves robust and persistent in vivo genome editing. Cell Reports. 22 (9), 2227-2235 (2018).
- Truong, B., et al. Lipid nanoparticle-targeted mRNA therapy as a treatment for the inherited metabolic liver disorder arginase deficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (42), 21150-21159 (2019).
- Cheng, Q., et al. Dendrimer-based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials. 30 (52), 1805308 (2018).
- Sedic, M., et al. Safety evaluation of lipid nanoparticle-formulated modified mRNA in the Sprague-Dawley rat and cynomolgus monkey. Veterinary Pathology. 55 (2), 341-354 (2018).
- Veiga, N., et al. Cell specific delivery of modified mRNA expressing therapeutic proteins to leukocytes. Nature Communications. 9 (1), 4493 (2018).
- Pattipeiluhu, R., et al. Anionic lipid nanoparticles preferentially deliver mRNA to the hepatic reticuloendothelial system. Advanced Materials. 34 (16), 2201095 (2022).
- Rosenblum, D., et al. CRISPR-Cas9 genome editing using targeted lipid nanoparticles for cancer therapy. Science Advances. 6 (47), (2020).
- Fenton, O. S., et al. Bioinspired alkenyl amino alcohol ionizable lipid materials for highly potent in vivo mRNA delivery. Advanced Materials. 28 (15), 2939-2943 (2016).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15 (11), 7300-7306 (2015).
- Tombácz, I., et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Molecular Therapy. 29 (11), 3293-3304 (2021).
- Kim, J., et al. Engineering lipid nanoparticles for enhanced intracellular delivery of mRNA through inhalation. Nano. 9 (9), 14792-14806 (2022).
- Bevers, S., et al. mRNA-LNP vaccines tuned for systemic immunization induce strong antitumor immunity by engaging splenic immune cells. Molecular Therapy. 30 (9), 3078-3094 (2022).
