Här presenteras ett protokoll för att formulera lipidnanopartiklar (LNP) som kapslar in mRNA som kodar för eldflugeluciferas. Dessa LNP:er testades för sin styrka in vitro i HepG2-celler och in vivo i C57BL/6-möss.
Lipidnanopartiklar (LNP) har väckt stor uppmärksamhet på senare tid i och med den framgångsrika utvecklingen av mRNA-vaccinerna mot covid-19 av Moderna och Pfizer/BioNTech. Dessa vacciner har visat effekten av mRNA-LNP-terapier och öppnat dörren för framtida kliniska tillämpningar. I mRNA-LNP-system fungerar LNP:erna som leveransplattformar som skyddar mRNA-lasten från nedbrytning av nukleaser och förmedlar deras intracellulära leverans. LNP:erna består vanligtvis av fyra komponenter: en joniserbar lipid, en fosfolipid, kolesterol och ett lipidförankrat polyetylenglykolkonjugat (PEG) (lipid-PEG). Här formuleras LNP:er som kapslar in mRNA-kodande eldflugeluciferas genom mikrofluidisk blandning av den organiska fasen som innehåller LNP-lipidkomponenter och den vattenhaltiga fasen som innehåller mRNA. Dessa mRNA-LNP:er testas sedan in vitro för att utvärdera deras transfektionseffektivitet i HepG2-celler med hjälp av en bioluminescerande plattbaserad analys. Dessutom utvärderas mRNA-LNPs in vivo i C57BL/6-möss efter en intravenös injektion via den laterala svansvenen. Helkroppsbioluminiscensavbildning utförs med hjälp av ett in vivo-avbildningssystem . Representativa resultat visas för mRNA-LNP-egenskaperna, deras transfektionseffektivitet i HepG2-celler och det totala luminescerande flödet i C57BL/6-möss.
Lipidnanopartiklar (LNP) har visat sig vara mycket lovande under de senaste åren inom området icke-viral genterapi. År 2018 godkände USA:s Food and Drug Administration (FDA) den första RNA-interferensterapin (RNAi) någonsin, Onpattro by Alnylam, för behandling av ärftlig transtyretinamyloidos 1,2,3,4. Detta var ett viktigt steg framåt för lipidnanopartiklar och RNA-baserade terapier. Nyligen fick Moderna och Pfizer/BioNTech FDA-godkännanden för sina mRNA-LNP-vacciner mot SARS-CoV-2 4,5. I var och en av dessa LNP-baserade nukleinsyraterapier tjänar LNP till att skydda sin last från nedbrytning av nukleaser och underlätta potent intracellulär leverans 6,7. Medan LNP:er har haft framgång inom RNAi-terapier och vaccintillämpningar, har mRNA-LNP:er också undersökts för användning i proteinersättningsterapier8 samt för samleverans av Cas9-mRNA och guide-RNA för leverans av CRISPR-Cas9-systemet för genredigering9. Det finns dock ingen specifik formulering som är väl lämpad för alla applikationer, och subtila förändringar i LNP-formuleringsparametrarna kan i hög grad påverka styrkan och biodistributionen in vivo 8,10,11. Därför måste enskilda mRNA-LNP:er utvecklas och utvärderas för att bestämma den optimala formuleringen för varje LNP-baserad terapi.
LNP formuleras vanligen med fyra lipidkomponenter: en joniserbar lipid, en fosfolipid, kolesterol och ett lipidförankrat polyetylenglykolkonjugat (PEG) (lipid-PEG)11,12,13. Den potenta intracellulära tillförseln som underlättas av LNP är delvis beroende av den joniserbara lipidkomponenten12. Denna komponent är neutral vid fysiologiskt pH men blir positivt laddad i den sura miljön i endosom11. Denna förändring i jonisk laddning tros vara en viktig bidragande orsak till endosomal flykt12,14,15. Förutom den joniserbara lipiden förbättrar fosfolipidkomponenten (hjälplipid) inkapslingen av lasten och hjälper till med endosomal flykt, kolesterolet erbjuder stabilitet och förbättrar membranfusionen, och lipid-PEG minimerar LNP-aggregering och opsonisering i cirkulationen10,11,14,16. För att formulera LNP kombineras dessa lipidkomponenter i en organisk fas, vanligtvis etanol, och blandas med en vattenfas som innehåller nukleinsyralasten. LNP-formuleringsprocessen är mycket mångsidig genom att den gör det möjligt att enkelt substituera och kombinera olika komponenter vid olika molförhållanden för att formulera många LNP-formuleringar med en mängd fysikalisk-kemiska egenskaper10,17. Men när man utforskar detta stora utbud av LNP:er är det avgörande att varje formulering utvärderas med hjälp av en standardiserad procedur för att noggrant mäta skillnaderna i karakterisering och prestanda.
Här beskrivs det fullständiga arbetsflödet för formulering av mRNA-LNP:er och bedömningen av deras prestanda i celler och djur.
Med detta arbetsflöde kan en mängd olika mRNA-LNP:er formuleras och testas för deras effektivitet in vitro och in vivo. Joniserbara lipider och hjälpämnen kan bytas ut och kombineras vid olika molarförhållanden och olika viktförhållanden mellan joniserbara lipider och mRNA för att producera mRNA-LNP med olika fysikalisk-kemiska egenskaper22. Här formulerade vi C12-200 mRNA-LNPs med ett molarförhållande på 35/16/46,5/2,5 (joniserbar lipid:hjälparlipid:kolesterol:lip…
The authors have nothing to disclose.
M.J.M. erkänner stöd från en US National Institutes of Health (NIH) Director’s New Innovator Award (DP2 TR002776), en Burroughs Wellcome Fund Career Award vid Scientific Interface (CASI), en US National Science Foundation CAREER-utmärkelse (CBET-2145491) och ytterligare finansiering från National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 och NIDDK R01 DK123049).
0.1 M Hydrochloric Acid | Sigma | 7647-01-0 | |
0.22 μm Syringe Filters | Genesee | 25-243 | |
1 mL BD Slip Tip Syringe | BD | 309659 | |
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
15 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
23G Needles | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
3 mL BD Disposable Syringes with Luer-Lok tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
3 mL Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | A52976 | |
96 Well Black Wall Black Bottom Plate | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | Thermo Scientific | 165306 | |
Ammonium Acetate, 1 Kilogram | Research Products International | 631-61-8 | |
Ammonium Citrate dibasic | SIgma | 3012-65-5 | |
BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 5 mL | BD | 309646 | |
C12-200 Ionizable Lipid | Cayman Chemical | 36699 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
Cholesterol | Sigma | 57-88-5 | |
CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955129 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Thermo Scientific | L2916 | |
DMEM, high glucose | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
Exel Insulin Syringes – 0.5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
HyPure Molecular Biology Grade Water | Cytiva | SH30538.03 | |
Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | N/A | |
Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
Luciferase Assay Kit | Promega | E4550 | |
NanoAssemblr Ignite Cartridges – Classic – 100 Pack | Precision Nanosystems | NIN0065 | |
NanoAssemblr Ignite Instrument | Precision Nanosystems | NIN0001 | |
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free | Thermo Scientific | AM9624 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
QB Citrate Buffer, (Citrate 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Scientific | R11490 | |
Reporter Lysis 5x Buffer | Promega | E3971 | |
RNase Away Surface Decontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
Sodium Chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
Sodium Hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
Sodium Phosphate | Sigma | 7601-54-9 | |
TNS reagent (6-(p-Toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid sodium salt) | Sigma | T9792 | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |