فحص بيولوجيا الدهون البيج والتمثيل الغذائي باستخدام نظام تنشيط CRISPR SunTag-p65-HSF1
Summary
يقدم هذا البروتوكول استخدام CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) في الخلايا الشحمية (AdipoSPH) كاستراتيجية بديلة للفيروس المرتبط بالغدي (AAV) للتحقيق في بيولوجيا الدهون البيج. الحقن في الجسم الحي من sgRNA الحامل ل AAV الذي يستهدف جين Prdm16 الداخلي يكفي للحث على نمو الدهون البيج وتعزيز برنامج الجينات الحرارية.
Abstract
وقد أدت تقنية التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (كريسبر) إلى ثورة في علم الأحياء، وتم تطبيق الأدوات الحديثة إلى ما هو أبعد من التحرير الجيني الموصوف أصلا. يجمع نظام تنشيط كريسبر (CRISPRa) بين بروتين Cas9 (dCas9) غير النشط تحفيزيا مع وحدات نسخ مميزة للحث على التعبير الجيني الداخلي. SunTag-p65-HSF1 (SPH) هي تقنية CRISPRa تم تطويرها مؤخرا تجمع بين مكونات وسطاء التنشيط التآزري (SAMs) مع منشطات SunTag. يسمح هذا النظام بالإفراط في التعبير عن الجينات المفردة أو المتعددة من خلال تصميم RNA أحادي التوجيه مخصص (sgRNA). في هذه الدراسة ، تم استخدام فأر SPH تم تطويره مسبقا لتوليد فأر شرطي يعبر عن SPH في الخلايا الشحمية (سلالة adiponectin Cre) ، المسماة AdipoSPH. للحث على النمط الظاهري للدهون البيضاء إلى البيج (البني) ، تم حقن فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل sgRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي (عامل نسخ راسخ يتعلق بتطور الدهون البنية والبيج) في الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT). حفز نموذج الفأر هذا التعبير عن Prdm16 الداخلي المنشأ ونشط برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، أدى التعبير المفرط ل Prdm16 الناجم عن SPH في المختبر إلى تعزيز استهلاك الأكسجين للخلايا الشحمية البيج ، مما أدى إلى نسخ نتائج نموذج الفئران المعدلة وراثيا Prdm16 السابق. وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول نموذج ماوس متعدد الاستخدامات وفعال من حيث التكلفة وفعال من حيث الوقت للتحقيق في بيولوجيا الأنسجة الدهنية.
Introduction
الخلايا الشحمية البيج (أو البريتي) هي خلايا دهنية تفصل عن البروتين 1 (UCP1) والخلايا الشحمية الغنية بالميتوكوندريا الموجودة داخل مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). تظهر الدهون البيج من مجموعة فرعية من أسلاف الخلايا الشحمية أو الخلايا الشحمية البيضاء الناضجة استجابة للتعرض للبرد والمحفزات الأخرى 1,2. يمكن للخلايا الشحمية البيج تحويل الطاقة إلى حرارة بطريقة تعتمد على UCP1 أو مستقلة3. بغض النظر عن وظيفتها الحرارية ، يمكن للدهون البيج أيضا تحسين صحة التمثيل الغذائي بوسائل أخرى ، مثل إفراز الأديبوكينات والأنشطة المضادة للالتهابات والمضادة للتليف. أظهرت الدراسات التي أجريت على الفئران والبشر أن تحريض الدهون البيج يحسن توازن الجلوكوز والدهون في الجسمبالكامل 3. ومع ذلك ، على الرغم من أن معرفتنا ببيولوجيا الدهون البيج قد تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة ، إلا أن معظم فوائدها الأيضية والآليات ذات الصلة لا تزال غير مفهومة تماما.
تم وصف التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) لأول مرة في الخلايا حقيقية النواة كأداة قادرة على توليد فاصل مزدوج الخيوط (DSB) في موقع معين في الجينوم من خلال نشاط النيوكلياز لبروتين Cas9 4,5. يتم توجيه Cas9 بواسطة الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه الاصطناعي (sgRNA) لاستهداف منطقة جينومية معينة ، مما يؤدي إلى DSB الحمض النووي. بالإضافة إلى استخدام النيوكلياز Cas9 لأغراض التحرير ، تطورت تقنية CRISPR-Cas9 لاستخدامها كأداة لتنظيم الجينات الخاصة بالتسلسل6. أدى تطوير بروتين Cas9 غير نشط تحفيزيا (dCas9) وربط وحدات النسخ القادرة على تعزيز التعبير الجيني إلى ظهور أدوات تنشيط كريسبر (CRISPRa). ظهرت العديد من أنظمة CRISPRa ، مثل VP647,8 ، وسيط التنشيط التآزري (SAM) 9 ، SunTag10,11 ، VPR12,13 ، و SunTag-p65-HSF1 (SPH) 14 ، والتي تجمع بين مكونات منشطات SAM و SunTag. لقد ثبت مؤخرا أن التعبير المستحث للجينات العصبية في الخلايا العصبية N2a والخلايا النجمية الأولية أعلى باستخدام SPH مقارنة بأنظمة CRISPRa الأخرى14 ، مما يدل على SPH كأداة CRISPRa واعدة.
هنا ، استفدنا من ماوس SPH14 الذي تم تطويره مسبقا لإنشاء نموذج فأر شرطي يعبر عن SPH على وجه التحديد في الخلايا الشحمية باستخدام سلالة adiponectin Cre (AdipoSPH). باستخدام فيروس مرتبط بالغدي (AAV) يحمل gRNA يستهدف جين Prdm16 الداخلي ، تم تحفيز اللون البني (التحويل الأبيض إلى البيج) من WAT الإربي (iWAT) لزيادة التعبير عن برنامج الجينات الحرارية. علاوة على ذلك ، في المختبر Prdm16 التعبير المفرط عزز استهلاك الأكسجين. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول نموذج ماوس SPH متعدد الاستخدامات لاستكشاف آليات تطور الدهون البيج داخل الأنسجة الدهنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحد أكثر التطبيقات غير التحريرية المفيدة لتقنية كريسبر هو استجواب وظيفة الجينات من خلال تنشيط الجينات الداخلية باستخدام أنظمة كريسبر6. SPH هو كريسبرا قوي تم وصفه في الأصل للحث على تحويل الخلايا النجمية إلى خلايا عصبية نشطة من خلال استهداف العديد من الجينات العصبية14</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدعم الذي تلقوه من مركز متعدد التخصصات للبحوث البيولوجية في العلوم الطبية (Cemib) ، Unicamp ، لتوليد الفئران AdipoSPH ، ومختبر Inmmunometabolism وإشارات الخلية ، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا على الضوئيات المطبقة على بيولوجيا الخلية (INFABIC) على كل الدعم التجريبي. نشكر الدعم المالي من مؤسسة أبحاث ساو باولو (FAPESP): 2019/15025-5 ؛ 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
