Étude de la biologie et du métabolisme des graisses beiges à l’aide du système d’activation CRISPR SunTag-p65-HSF1
Summary
Ce protocole présente l’utilisation de CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) dans les adipocytes (AdipoSPH) comme stratégie alternative au virus adéno-associé (AAV) pour étudier la biologie de la graisse beige. L’injection in vivo d’ARNg porteur d’AAV ciblant le gène endogène Prdm16 est suffisante pour induire le développement de graisse beige et améliorer le programme de gènes thermogéniques.
Abstract
La technologie CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) a provoqué une révolution en biologie, et des outils récents ont été appliqués bien au-delà de l’édition de gènes décrite à l’origine. Le système d’activation CRISPR (CRISPRa) combine la protéine catalytiquement inactive Cas9 (dCas9) avec des modules de transcription distincts pour induire l’expression endogène des gènes. SunTag-p65-HSF1 (SPH) est une technologie CRISPRa récemment développée qui combine des composants de médiateurs d’activation synergiques (SAM) avec les activateurs SunTag. Ce système permet la surexpression d’un ou de plusieurs gènes en concevant un ARN monoguide personnalisé (sgRNA). Dans cette étude, une souris SPH précédemment développée a été utilisée pour générer une souris conditionnelle exprimant la SPH dans les adipocytes (lignée de l’adiponectine Cre), appelée AdipoSPH. Pour induire un phénotype de graisse blanche à beige (brunissant), un virus adéno-associé (AAV) porteur d’ARNg ciblant le gène endogène Prdm16 (un facteur de transcription bien établi lié au développement de la graisse brune et beige) a été injecté dans le tissu adipeux blanc inguinal (iWAT). Ce modèle murin a induit l’expression de Prdm16 endogène et activé le programme de gènes thermogéniques. De plus, la surexpression in vitro de Prdm16 induite par SPH a augmenté la consommation d’oxygène des adipocytes beiges, phénocopiant les résultats d’un précédent modèle murin transgénique Prdm16. Ainsi, ce protocole décrit un modèle murin polyvalent, rentable et rapide pour étudier la biologie du tissu adipeux.
Introduction
Les adipocytes beiges (ou brite) sont des adipocytes exprimant la protéine 1 (UCP1) et des adipocytes riches en mitochondries qui résident dans des dépôts de tissu adipeux blanc (WAT). La graisse beige émerge d’un sous-ensemble de progéniteurs adipocytaires ou d’adipocytes blancs matures en réponse à l’exposition au froid et à d’autres stimuli 1,2. Les adipocytes beiges peuvent convertir l’énergie en chaleur d’une manière dépendante ou indépendante de UCP13. Indépendamment de sa fonction thermogénique, la graisse beige peut également améliorer la santé métabolique par d’autres moyens, tels que la sécrétion d’adipokines et les activités anti-inflammatoires et anti-fibrotiques. Des études chez la souris et l’homme ont montré que l’induction de graisse beige améliore le glucose dans tout le corps et l’homéostasie lipidique3. Cependant, bien que nos connaissances sur la biologie de la graisse beige aient évolué rapidement ces dernières années, la plupart de ses avantages métaboliques et des mécanismes connexes ne sont pas encore entièrement compris.
Les courtes répétitions palindromiques groupées régulièrement espacées (CRISPR) ont d’abord été décrites dans des cellules eucaryotes comme un outil capable de générer une rupture double brin (DSB) à un site spécifique du génome par l’activité nucléase de la protéine Cas9 4,5. Cas9 est guidé par un ARN monoguide synthétique (sgRNA) pour cibler une région génomique spécifique, conduisant à un ADN DSB. En plus d’utiliser la nucléase Cas9 à des fins d’édition, la technologie CRISPR-Cas9 a évolué pour être utilisée comme outil de régulation génique spécifiqueà la séquence 6. Le développement d’une protéine Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) et l’association de modules transcriptionnels capables d’améliorer l’expression génique ont donné naissance à des outils d’activation CRISPR (CRISPRa). Plusieurs systèmes CRISPRa ont vu le jour, tels que VP647,8, médiateur d’activation synergique (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 et SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, qui combine les composants des activateurs SAM et SunTag. Il a récemment été démontré que l’expression induite des gènes neurogènes dans les neuroblastes N2a et les astrocytes primaires est plus élevée en utilisant SPH par rapport aux autres systèmes CRISPRa14, démontrant SPH comme un outil CRISPRa prometteur.
Ici, nous avons profité d’une souris SPH14 précédemment développée pour générer un modèle murin conditionnel exprimant la SPH spécifiquement dans les adipocytes en utilisant la lignée Cre adiponectine (AdipoSPH). En utilisant un virus adéno-associé (AAV) portant l’ARNg ciblant le gène endogène Prdm16, le brunissement (conversion blanc en beige) de WAT inguinal (iWAT) a été induit pour augmenter l’expression du programme de gène thermogénique. De plus, la surexpression in vitro de Prdm16 a augmenté la consommation d’oxygène. Par conséquent, ce protocole fournit un modèle murin SPH polyvalent pour explorer les mécanismes de développement de la graisse beige dans le tissu adipeux.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’une des applications non éditrices les plus utiles de la technologie CRISPR est l’interrogation de la fonction des gènes par l’activation de gènes endogènes à l’aide de systèmes CRISPRa6. SPH est un puissant CRISPRa qui a été décrit à l’origine pour induire la conversion des astrocytes en neurones actifs en ciblant plusieurs gènes neurogènes14. Dans cette étude, AdipoSPH s’est avéré être un outil approprié pour étudier la biologie des graisse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le soutien reçu du Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, pour la génération de souris AdipoSPH, du Laboratoire d’inmmunométabolisme et de signalisation cellulaire et de l’Institut national des sciences et technologies en photonique appliquée à la biologie cellulaire (INFABIC) pour tout le soutien expérimental. Nous remercions le soutien financier de la Fondation de recherche de Sao Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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