Investigación de la biología y el metabolismo de la grasa beige utilizando el sistema de activación CRISPR SunTag-p65-HSF1
Summary
Este protocolo presenta el uso de CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) en adipocitos (AdipoSPH) como una estrategia alternativa al virus adenoasociado (AAV) para investigar la biología de la grasa beige. La inyección in vivo de ARNg portador de AAV dirigida al gen endógeno Prdm16 es suficiente para inducir el desarrollo de grasa beige y mejorar el programa de genes termogénicos.
Abstract
La tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) ha provocado una revolución en la biología, y las herramientas recientes se han aplicado mucho más allá de la edición de genes descrita originalmente. El sistema de activación CRISPR (CRISPRa) combina la proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) con distintos módulos de transcripción para inducir la expresión génica endógena. SunTag-p65-HSF1 (SPH) es una tecnología CRISPRa recientemente desarrollada que combina componentes de mediadores de activación sinérgicos (SAM) con los activadores SunTag. Este sistema permite la sobreexpresión de genes únicos o múltiples mediante el diseño de un ARN guía única personalizado (sgRNA). En este estudio, se utilizó un ratón SPH previamente desarrollado para generar un ratón condicional que expresa SPH en adipocitos (linaje adiponectina Cre), llamado AdipoSPH. Para inducir un fenotipo de grasa blanca a beige (pardeamiento), se inyectó un virus adenoasociado (AAV) portador de sgRNA dirigido al gen endógeno Prdm16 (un factor de transcripción bien establecido relacionado con el desarrollo de grasa marrón y beige) en el tejido adiposo blanco inguinal (iWAT). Este modelo de ratón indujo la expresión endógena de Prdm16 y activó el programa del gen termogénico. Además, la sobreexpresión de Prdm16 inducida por SPH in vitro aumentó el consumo de oxígeno de los adipocitos beige, fenocopiando los resultados de un modelo previo de ratón transgénico Prdm16. Por lo tanto, este protocolo describe un modelo de ratón versátil, rentable y rentable para investigar la biología del tejido adiposo.
Introduction
Los adipocitos beige (o brite) son adipocitos ricos en mitocondrias que expresan la proteína 1 (UCP1) y que residen dentro de los depósitos de tejido adiposo blanco (WAT). La grasa beige emerge de un subconjunto de progenitores adipocitos o adipocitos blancos maduros en respuesta a la exposición al frío y otros estímulos 1,2. Los adipocitos beige pueden convertir la energía en calor de una manera dependiente de UCP1 o independiente3. Independientemente de su función termogénica, la grasa beige también puede mejorar la salud metabólica por otros medios, como la secreción de adipoquinas y actividades antiinflamatorias y antifibróticas. Los estudios en ratones y humanos han demostrado que la inducción de grasa beige mejora la homeostasis de la glucosa y los lípidos de todo el cuerpo3. Sin embargo, aunque nuestro conocimiento de la biología de la grasa beige ha evolucionado rápidamente en los últimos años, la mayoría de sus beneficios metabólicos y mecanismos relacionados aún no se comprenden completamente.
Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) se describieron por primera vez en células eucariotas como una herramienta capaz de generar una ruptura de doble cadena (DSB) en un sitio específico del genoma a través de la actividad nucleasa de la proteína Cas9 4,5. Cas9 es guiado por un ARN sintético de guía única (sgRNA) para dirigirse a una región genómica específica, lo que lleva a un ADN DSB. Además de utilizar la nucleasa Cas9 con fines de edición, la tecnología CRISPR-Cas9 ha evolucionado para ser utilizada como una herramienta de regulación génica específica de secuencia6. El desarrollo de una proteína Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) y la asociación de módulos transcripcionales capaces de mejorar la expresión génica ha dado lugar a herramientas de activación CRISPR (CRISPRa). Han surgido varios sistemas CRISPRa, como VP647,8, mediador de activación sinérgica (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 y SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, que combina los componentes de los activadores SAM y SunTag. Recientemente se ha demostrado que la expresión inducida de genes neurogénicos en neuroblastos N2a y astrocitos primarios es mayor utilizando SPH en comparación con otros sistemas CRISPRa14, demostrando SPH como una herramienta CRISPRa prometedora.
Aquí, aprovechamos un ratón SPH14 previamente desarrollado para generar un modelo de ratón condicional que expresa SPH específicamente en adipocitos utilizando el linaje de adiponectina Cre (AdipoSPH). Usando un virus adenoasociado (AAV) portador del ARNg dirigido al gen endógeno Prdm16, se indujo el pardeamiento (conversión de blanco a beige) de WAT inguinal (iWAT) para aumentar la expresión del programa de genes termogénicos. Además, la sobreexpresión in vitro de Prdm16 mejoró el consumo de oxígeno. Por lo tanto, este protocolo proporciona un modelo versátil de ratón SPH para explorar los mecanismos del desarrollo de grasa beige dentro del tejido adiposo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una de las aplicaciones no editativas más útiles de la tecnología CRISPR es la interrogación de la función génica mediante la activación de genes endógenos utilizando sistemas CRISPRa6. SPH es un potente CRISPRa que fue descrito originalmente para inducir la conversión de astrocitos en neuronas activas al dirigirse a varios genes neurogénicos14. En este estudio, AdipoSPH demostró ser una herramienta adecuada para investigar la biología de la grasa beige mediante…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo recibido del Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, para la generación de ratones AdipoSPH, el Laboratorio de Inmmunometabolismo y Señalización Celular, y el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología sobre Fotónica Aplicada a la Biología Celular (INFABIC) por todo el apoyo experimental. Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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