Undersøgelse af beige fedtbiologi og stofskifte ved hjælp af CRISPR SunTag-p65-HSF1 aktiveringssystemet
Summary
Denne protokol præsenterer brugen af CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) i adipocytter (AdipoSPH) som en alternativ strategi til adeno-associeret virus (AAV) til undersøgelse af beige fedtbiologi. In vivo-injektion af AAV-bærende sgRNA rettet mod det endogene Prdm16-gen er tilstrækkeligt til at inducere beige fedtudvikling og forbedre det termogene genprogram.
Abstract
Clustered regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) teknologi har medført en revolution i biologi, og nyere værktøjer er blevet anvendt langt ud over den oprindeligt beskrevne genredigering. CRISPR-aktiveringssystemet (CRISPRa) kombinerer det katalytisk inaktive Cas9 (dCas9) protein med forskellige transkriptionsmoduler for at inducere endogen genekspression. SunTag-p65-HSF1 (SPH) er en nyudviklet CRISPRa-teknologi, der kombinerer komponenter fra synergistiske aktiveringsmediatorer (SAM’er) med SunTag-aktivatorerne. Dette system tillader overekspression af enkelte eller flere gener ved at designe et tilpasset single-guide RNA (sgRNA). I denne undersøgelse blev en tidligere udviklet SPH-mus brugt til at generere en betinget mus, der udtrykker SPH i adipocytter (adiponectin Cre-afstamning), kaldet AdipoSPH. For at inducere en hvid-til-beige fedt (bruning) fænotype blev en adeno-associeret virus (AAV), der bærer sgRNA rettet mod det endogene Prdm16-gen (en veletableret transkriptionsfaktor relateret til brun og beige fedtudvikling) injiceret i det inguinale hvide fedtvæv (iWAT). Denne musemodel inducerede ekspression af endogene Prdm16 og aktiverede det termogene genprogram. Desuden forbedrede in vitro SPH-induceret Prdm16-overekspression iltforbruget af beige adipocytter, fænokopiering af resultaterne af en tidligere Prdm16 transgen musemodel. Således beskriver denne protokol en alsidig, omkostningseffektiv og tidseffektiv musemodel til undersøgelse af fedtvævsbiologi.
Introduction
Beige (eller brite) adipocytter afkobler protein 1 (UCP1)-ekspressive og mitokondrierige adipocytter, der befinder sig i hvide fedtvæv (WAT) depoter. Beige fedt fremkommer fra en delmængde af adipocytforfædre eller modne hvide adipocytter som reaktion på kuldeeksponering og andre stimuli 1,2. Beige adipocytter kan omdanne energi til varme på en UCP1-afhængig eller uafhængig måde3. Uanset dets termogene funktion kan beige fedt også forbedre metabolisk sundhed på andre måder, såsom udskillelse af adipokiner og antiinflammatoriske og antifibrotiske aktiviteter. Undersøgelser hos mus og mennesker har vist, at induktion af beige fedt forbedrer helkropsglukose og lipidhomeostase3. Men selvom vores viden om beige fedtbiologi har udviklet sig hurtigt i de senere år, er de fleste af dens metaboliske fordele og relaterede mekanismer stadig ikke fuldt ud forstået.
Grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) blev først beskrevet i eukaryote celler som et værktøj, der er i stand til at generere et dobbeltstrengsbrud (DSB) på et specifikt sted i genomet gennem nukleaseaktiviteten af Cas9-proteinet 4,5. Cas9 styres af et syntetisk single-guide RNA (sgRNA) til at målrette mod en specifik genomisk region, hvilket fører til en DNA DSB. Ud over at bruge nukleasen Cas9 til redigeringsformål har CRISPR-Cas9-teknologien udviklet sig til at blive brugt som et sekvensspecifikt genreguleringsværktøj6. Udviklingen af et katalytisk inaktivt Cas9-protein (dCas9) og foreningen af transkriptionsmoduler, der er i stand til at forbedre genekspression, har givet anledning til CRISPR-aktiveringsværktøjer (CRISPRa). Flere CRISPRa-systemer er dukket op, såsom VP647,8, synergistisk aktiveringsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 og SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, som kombinerer komponenterne i SAM- og SunTag-aktivatorer. Det er for nylig blevet påvist, at den inducerede ekspression af neurogene gener i N2a-neuroblaster og primære astrocytter er højere ved hjælp af SPH sammenlignet med andre CRISPRa-systemer14, hvilket viser SPH som et lovende CRISPRa-værktøj.
Her udnyttede vi en tidligere udviklet SPH-mus14 til at generere en betinget musemodel, der udtrykker SPH specifikt i adipocytter ved hjælp af adiponectin Cre-afstamningen (AdipoSPH). Ved hjælp af en adeno-associeret virus (AAV), der bærer gRNA’et rettet mod det endogene Prdm16-gen, blev brunfarvning (hvid til beige konvertering) af inguinal WAT (iWAT) induceret for at øge ekspressionen af det termogene genprogram. Desuden øgede in vitro Prdm16 overekspression iltforbruget. Derfor giver denne protokol en alsidig SPH-musemodel til at udforske mekanismerne for beige fedtudvikling i fedtvæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
En af de mest nyttige ikke-redigeringsanvendelser af CRISPR-teknologi er forhør af genfunktion gennem aktivering af endogene gener ved hjælp af CRISPRa-systemer6. SPH er en kraftfuld CRISPRa, der oprindeligt blev beskrevet for at inducere omdannelsen af astrocytter til aktive neuroner ved at målrette mod flere neurogene gener14. I denne undersøgelse blev AdipoSPH påvist at være et egnet værktøj til at undersøge beige fedtbiologi ved at aktivere ekspressionen af end…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker støtten fra Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, til generering af AdipoSPH-mus, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory og National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) for al eksperimentel støtte. Vi takker den økonomiske støtte fra Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
