Untersuchung der Biologie und des Stoffwechsels von beigefarbenem Fett mit dem CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivierungssystem
Summary
Dieses Protokoll stellt die Verwendung von CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in Adipozyten (AdipoSPH) als alternative Strategie zum Adeno-assoziierten Virus (AAV) zur Untersuchung der Biologie von beigem Fett dar. Die In-vivo-Injektion von AAV-tragender sgRNA, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, reicht aus, um die Entwicklung von beigem Fett zu induzieren und das thermogene Genprogramm zu verbessern.
Abstract
Die CRISPR-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hat eine Revolution in der Biologie ausgelöst, und neuere Werkzeuge wurden weit über die ursprünglich beschriebene Genom-Editierung hinaus eingesetzt. Das CRISPR-Aktivierungssystem (CRISPRa) kombiniert das katalytisch inaktive Cas9 (dCas9)-Protein mit verschiedenen Transkriptionsmodulen, um eine endogene Genexpression zu induzieren. SunTag-p65-HSF1 (SPH) ist eine neu entwickelte CRISPRa-Technologie, die Komponenten von synergistischen Aktivierungsmediatoren (SAMs) mit den SunTag-Aktivatoren kombiniert. Dieses System ermöglicht die Überexpression einzelner oder mehrerer Gene durch das Design einer maßgeschneiderten Single-Guide-RNA (sgRNA). In dieser Studie wurde eine zuvor entwickelte SPH-Maus verwendet, um eine bedingte Maus zu erzeugen, die SPH in Adipozyten exprimiert (Adiponektin-Cre-Linie), genannt AdipoSPH. Um einen Phänotyp von weißem bis beigem Fett (Bräunung) zu induzieren, wurde ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV), das sgRNA trägt, das auf das endogene Prdm16-Gen (ein gut etablierter Transkriptionsfaktor, der mit der Entwicklung von braunem und beigem Fett in Verbindung steht) abzielt, in das weiße Leistenfettgewebe (iWAT) injiziert. Dieses Mausmodell induzierte die Expression von endogenem Prdm16 und aktivierte das thermogene Genprogramm. Darüber hinaus erhöhte die in vitro SPH-induzierte Prdm16-Überexpression den Sauerstoffverbrauch von beigen Adipozyten und phänokopierte damit die Ergebnisse eines früheren transgenen Prdm16-Mausmodells. Somit beschreibt dieses Protokoll ein vielseitiges, kostengünstiges und zeiteffektives Mausmodell zur Untersuchung der Fettgewebebiologie.
Introduction
Beige (oder Brite) Adipozyten sind entkoppelnde Protein 1 (UCP1)-exprimierende und mitochondriale Adipozyten, die sich in Depots für weißes Fettgewebe (WAT) befinden. Beigefett entsteht aus einer Untergruppe von Adipozyten-Vorläuferzellen oder reifen weißen Adipozyten als Reaktion auf Kälteeinwirkung und andere Reize 1,2. Beige Adipozyten können UCP1-abhängig oder unabhängig Energie in Wärme umwandeln3. Unabhängig von seiner thermogenen Funktion kann beigefarbenes Fett auch auf andere Weise die Stoffwechselgesundheit verbessern, z. B. durch die Sekretion von Adipokinen und entzündungshemmende und antifibrotische Aktivitäten. Studien an Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass die Induktion von beigem Fett die Glukose- und Lipidhomöostase des ganzen Körpers verbessert3. Obwohl sich unser Wissen über die Biologie von beigem Fett in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt hat, sind die meisten seiner metabolischen Vorteile und die damit verbundenen Mechanismen immer noch nicht vollständig verstanden.
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) wurden erstmals in eukaryotischen Zellen als ein Werkzeug beschrieben, das in der Lage ist, durch die Nukleaseaktivität des Cas9-Proteins einen Doppelstrangbruch (DSB) an einer bestimmten Stelle im Genom zu erzeugen 4,5. Cas9 wird von einer synthetischen Single-Guide-RNA (sgRNA) gesteuert, um auf eine bestimmte genomische Region abzuzielen, was zu einem DNA-DSB führt. Neben der Verwendung der Nuklease Cas9 für die Editierung hat sich die CRISPR-Cas9-Technologie weiterentwickelt, um als sequenzspezifisches Genregulationswerkzeug eingesetzt zu werden6. Die Entwicklung eines katalytisch inaktiven Cas9-Proteins (dCas9) und die Assoziation von Transkriptionsmodulen, die in der Lage sind, die Genexpression zu verbessern, haben zu CRISPR-Aktivierungswerkzeugen (CRISPRa) geführt. Es sind mehrere CRISPRa-Systeme entstanden, wie z. B. VP647,8, synergistischer Aktivierungsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 und SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, das die Komponenten von SAM- und SunTag-Aktivatoren kombiniert. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die induzierte Expression neurogener Gene in N2a-Neuroblasten und primären Astrozyten mit SPH im Vergleich zu anderen CRISPRa-Systemen höher ist14, was SPH als vielversprechendes CRISPRa-Werkzeug demonstriert.
In dieser Arbeit nutzten wir eine zuvor entwickelte SPH-Maus14 , um ein bedingtes Mausmodell zu generieren, das SPH spezifisch in Adipozyten exprimiert, indem wir die Adiponektin-Cre-Linie (AdipoSPH) verwenden. Mit Hilfe eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das die gRNA trägt, die auf das endogene Prdm16-Gen abzielt, wurde die Bräunung (Umwandlung von weiß in beige) von inguinalem WAT (iWAT) induziert, um die Expression des thermogenen Genprogramms zu erhöhen. Darüber hinaus erhöhte die in vitro Überexpression von Prdm16 den Sauerstoffverbrauch. Daher stellt dieses Protokoll ein vielseitiges SPH-Mausmodell zur Verfügung, um die Mechanismen der beigen Fettentwicklung im Fettgewebe zu erforschen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine der nützlichsten Nicht-Editing-Anwendungen der CRISPR-Technologie ist die Abfrage der Genfunktion durch die Aktivierung endogener Gene mit Hilfe von CRISPRa-Systemen6. SPH ist ein starkes CRISPRa, von dem ursprünglich beschrieben wurde, dass es die Umwandlung von Astrozyten in aktive Neuronen induziert, indem es auf mehrere neurogene Gene abzielt14. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass AdipoSPH ein geeignetes Werkzeug zur Untersuchung der Biologie von beigem …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp für die Erzeugung von AdipoSPH-Mäusen, dem Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory und dem National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) für die experimentelle Unterstützung. Wir danken für die finanzielle Unterstützung der São Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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