배아 및 간 제브라피쉬 세포주의 스페로이드에 대한 3D 배양 방법
Summary
여기에서 우리는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)의 스페로이드 형성을 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
어류 세포주는 생태 독성 평가를 위한 시험관 내 모델이 유망합니다. 그러나, 종래의 단층 배양 시스템(2D 배양)은 잘 알려진 한계(예를 들어, 배양 수명 및 일부 생체내 세포 기능의 유지)를 갖는다. 따라서, 스페로이드와 같은 3D 배양이 제안되었는데, 그 이유는 이러한 모델이 조직과 같은 구조를 재현할 수 있고, 생체 내 조건을 더 잘 재포착할 수 있기 때문이다. 이 기사에서는 두 개의 제브라피쉬(Danio rerio) 세포주인 ZEM2S(배아) 및 ZFL(정상 간세포)을 사용하여 스페로이드를 형성하기 위한 효과적이고 쉽고 빠른 3D 배양 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 둥근 바닥, 초저 부착, 96웰 플레이트에 세포를 도금하는 것으로 구성됩니다. 오비탈 쉐이킹(70 rpm) 하에서 5일 후, 웰 당 단일 스페로이드가 형성된다. 형성된 스페로이드는 안정적인 크기와 모양을 나타내며, 이 방법은 웰에서 여러 스페로이드가 형성되는 것을 방지합니다. 따라서 비슷한 크기의 스페로이드를 직접 고를 필요가 없습니다. 이 스페로이드 분석법의 용이성, 속도 및 재현성은 고처리량 in vitro 테스트에 유용합니다.
Introduction
스페로이드는 3D 배양에서 세포가 세포 간 밀접하게 접촉하여 배양될 때 형성되는 작은 세포 구체입니다. 생체 내 조직 환경을 모방하는 스페로이드의 능력은 이미 다양한 세포주와 일차 세포에서 연구되었습니다 1,2. 그러나, 스페로이드가 포유류 독성 연구를 위해 잘 개발되어 있지만, 비포유류 척추동물(예: 어류)을 이용한 독성 연구를 위한 스페로이드의 개발은 아직 진행 중이다3. 어류 세포주의 경우, 스페로이드는 다양한 유형의 웰 플레이트 (3,4,5,6,7)를 사용하는 궤도 쉐이킹 (orbital shaking, OS) 및 자성 나노 입자8를 이용한 자기 부상 방법(2)과 같은 다양한 방법으로 개발되었다. 그러나 스페로이드에 대한 이러한 배양 방법 중 일부는 다른 방법보다 더 많은 단점을 가질 수 있습니다.
예를 들어, 대형 마이크로플레이트(24웰 플레이트)의 선회 방법은 크기와 모양이 다른 많은 수의 스페로이드를 생성할 수 있습니다. 실제로, 다중 스페로이드 구조 형성이 입증되었습니다7. 이를 위해서는 실험을 위해 비슷한 크기와 모양의 스페로이드를 직접 선택하려는 많은 노력이 필요합니다. 행드롭 3D 배양 방법은 포유 동물 세포주 1,2,9,10,11의 스페로이드를 생성하는데 통상적으로 사용되며, 이에 의해 한 방울 당 단일 스페로이드가 생성될 수 있어, 상술한 문제를 피할 수 있다. 그러나, 변형된 행잉 드롭 방법(행잉 드롭 + 오비탈 쉐이킹)은 저렴한 방법을 사용하여 ZFL 스페로이드를 생성할 수 있지만, 그 단점이 있다12. 형성된 세포 응집체는 방울에서 장기간 유지 될 수 없습니다. 따라서 우물 판으로 옮겨야합니다. 이 공정은 층류 후드에서 강렬한 취급과 장기간의 작업을 필요로 하는데, 이는 마이크로피펫(micropipette)(12)을 사용하여 적가(dropwise)하기 때문이다. 또한, 이 방법은 ZFL 스페로이드를 완전히 형성하는 데 10일이 걸립니다(행잉 드롭에서 5일 + OS에서 5일)12. 이러한 단점은 특히 화학적 우선 순위 지정 및 제품 지속 가능성에 대한 잠재적 응용 분야를 고려할 때 독성 테스트를 위한 3D 어류 스페로이드의 적용을 제한할 수 있습니다.
따라서 이 기사에서는 96웰, 초저부착 플레이트(ULA-plates) 및 궤도 쉐이커(회전 직경 22mm)의 조합을 기반으로 ZFL(D. rerio normal hepatocyte) 및 ZEM2S(D. rerio blastula phase embryo) 세포주의 단일 스페로이드를 생성할 수 있는 3D 배양 프로토콜에 대해 설명합니다. 적용된 방법은 간단하고 재현 가능하며 단기간(5일)에 유사한 크기와 모양의 스페로이드를 대량으로 생성할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 산업계와 학계 모두에서 수생 독성 연구를 위한 어류 3D 모델의 적용과 생태 독성 테스트를 위한 대체 방법의 구현 진행을 지원할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이것은 제브라피쉬 간 및 배아 세포주의 스페로이드를 생성하기 위한 간단하고 쉽고 빠른 방법입니다. 이 방법은 스페로이드 형성과 관련된 과학적 연구에서 보고된 문제와 3D 스페로이드 분석의 데이터 정확도 불확실성을 극복하기 위해 기존 3D 스페로이드 방법을 수정하여 개발했습니다. 예를 들어, 보고된 문제는 취급의 어려움, 스페로이드 생성의 시간 소모적인 특성, 분석을 수행하기 위해 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구의 공동 저자 인 Márcio Lorencini 박사를 기리기 위해 화장품 분야의 우수한 연구원이자 브라질에서 화장품 연구를 촉진하는 데 전념했습니다. 저자는 장비 가용성과 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES, 브라질) (재정 코드 001) 및 Grupo Boticário의 재정 지원에 대해 생리학 부서 (UFPR)의 다중 사용자 실험실에 감사드립니다.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids – A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022)
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
