Microvasculaire en macrovasculaire endotheliale celisolatie en zuivering van longmonsters
Summary
Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.
Abstract
De beschikbaarheid van cellen geïsoleerd uit gezonde en zieke weefsels en organen vormt een sleutelelement voor gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen. Hoewel biobanken een brede verzameling primaire en onsterfelijke cellen voor biomedisch onderzoek kunnen bieden, dekken deze niet alle experimentele behoeften, met name die met betrekking tot specifieke ziekten of genotypen. Vasculaire endotheelcellen (EC’s) zijn belangrijke componenten van de immuunontstekingsreactie en spelen dus een centrale rol in de pathogenese van een verscheidenheid aan aandoeningen. Met name EC’s van verschillende locaties vertonen verschillende biochemische en functionele eigenschappen, waardoor de beschikbaarheid van specifieke EC-typen (d.w.z. macrovasculair, microvasculair, arterieel en veneus) essentieel is voor het ontwerpen van betrouwbare experimenten. Hier worden eenvoudige procedures voor het verkrijgen van hoogrenderende, vrijwel zuivere menselijke macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen uit de longslagader en longparenchym in detail geïllustreerd. Deze methode kan gemakkelijk worden gereproduceerd tegen relatief lage kosten door elk laboratorium om onafhankelijk te worden van commerciële bronnen en EC-fenotypen / genotypen te verkrijgen die nog niet beschikbaar zijn.
Introduction
Het vasculaire endotheel bekleedt het binnenoppervlak van de bloedvaten. Het speelt een sleutelrol bij het reguleren van bloedstolling, vasculaire tonus en immuun-inflammatoire reacties 1,2,3,4. Hoewel de kweek van endotheelcellen (EC’s) geïsoleerd uit menselijke specimens essentieel is voor onderzoeksdoeleinden, moet worden opgemerkt dat de EC’s uit verschillende bloedvaten (slagaders, aderen, haarvaten) specifieke functies hebben. Deze kunnen niet volledig worden samengevat door humane navelstreng-endotheelcellen (HUVEC), die gemakkelijk verkrijgbaar zijn en op grote schaal worden gebruikt in studies naar vasculaire endotheelpathofysiologie 5,6. Menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen (HLMVECs) spelen bijvoorbeeld een sleutelrol bij longontsteking door de rekrutering en accumulatie van leukocyten te beheersen 4,7. Een experimentele setting gericht op het reproduceren van longontsteking met hoge getrouwheid zou dus HLMVEC’s moeten omvatten. Aan de andere kant kan EC-disfunctie worden waargenomen in verschillende pathologieën; daarom zijn EC’s van de patiënt van fundamenteel belang voor het bouwen van een betrouwbaar in vitro model van de ziekte. Bijvoorbeeld, de isolatie van fragmenten van EC’s uit de longslagader (HPAECs), ontleed uit de geëxplanteerde longen van mensen die getroffen zijn door cystic fibrosis (CF), hebben ons in staat gesteld om mechanismen van endotheeldisfunctie bij deze ziekte te ontdekken 8,9.
Protocollen gericht op het optimaliseren van de isolatie van EC’s uit verschillende bronnen / organen, ook in ziektetoestanden, zijn dus essentieel om onderzoekers waardevolle onderzoeksinstrumenten te bieden, vooral wanneer deze hulpmiddelen niet commercieel beschikbaar zijn. HLMVEC- en HPAEC-isolatieprotocollen zijn eerder gemeld 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In alle gevallen resulteerde de enzymatische vertering van de longmonsters in gemengde celpopulaties, die werden gezuiverd met behulp van ad hoc selectieve media en magnetische kralen- of cytometrische celsortering. Verdere optimalisaties van deze protocollen moeten twee belangrijke problemen in EG-isolatie aanpakken: (1) cel- en weefselverontreiniging, die zo snel mogelijk moet worden opgelost om EG-replicatieve senescentie te minimaliseren20; en (2) de lage opbrengst van primaire EC-isolaten.
Deze studie beschrijft een nieuw protocol voor de high-yield, high-purity isolatie van HLMVECs en HPAECs. Deze procedure kan eenvoudig toepasbaar zijn en geeft in een paar stappen vrijwel zuivere macrovasculaire en microvasculaire EC’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
De vele rollen die vasculaire endotheelcellen spelen in de menselijke pathofysiologie maken deze cellen een onmisbaar hulpmiddel voor in vitro pathogenetische en farmacologische studies. Aangezien EC’s van verschillende vasculaire locaties / organen eigenaardige kenmerken en functies vertonen, zou de beschikbaarheid van gezonde en zieke EC’s van het orgaan van belang ideaal zijn voor onderzoeksdoeleinden. HLMVECs zijn bijvoorbeeld essentieel voor studies naar longontsteking; Daarom zal een methodologie voor de h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen van het Italiaanse ministerie van de Universiteit en Onderzoek (ex 60% 2021 en 2022) aan R. P. en door subsidies van de Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation (FFC # 23/2014) en van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (L548/93) aan M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
