Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples(폐 유래 샘플에서 미세혈관 및 대혈관 내피 세포 분리 및 정제)
Summary
어렵지만 폐 내피 세포의 분리는 폐 염증 연구에 필수적입니다. 본 프로토콜은 대혈관 및 미세혈관 내피 세포의 고수율, 고순도 단리를 위한 절차를 설명한다.
Abstract
건강하고 병든 조직 및 기관에서 분리된 세포의 가용성은 개인화된 의학 접근의 핵심 요소입니다. 바이오뱅크는 생물의학 연구를 위한 광범위한 1차 및 불멸화 세포 컬렉션을 제공할 수 있지만, 이러한 것들이 모든 실험 요구, 특히 특정 질병이나 유전자형과 관련된 것들을 충족시키지는 못합니다. 혈관 내피 세포(EC)는 면역 염증 반응의 핵심 구성 요소이므로 다양한 장애의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 특히, 서로 다른 부위의 EC는 서로 다른 생화학적 및 기능적 특성을 나타내므로 신뢰할 수 있는 실험을 설계하는 데 특정 EC 유형(즉, 대혈관, 미세혈관, 동맥 및 정맥)의 가용성이 필수적입니다. 여기에서는 폐동맥 및 폐 실질로부터 고수율, 사실상 순수한 인간 대혈관 및 미세혈관 내피 세포를 얻기 위한 간단한 절차가 상세히 설명된다. 이 방법론은 상업적 출처로부터 독립성을 달성하고 아직 사용할 수 없는 EC 표현형/유전자형을 얻기 위해 모든 실험실에서 비교적 저렴한 비용으로 쉽게 재현할 수 있습니다.
Introduction
혈관 내피는 혈관의 내부 표면을 따라 늘어서 있습니다. 혈액 응고, 혈관 긴장도 및 면역 염증 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4. 인간 표본에서 분리된 내피 세포(EC)의 배양은 연구 목적에 필수적이지만 다른 혈관(동맥, 정맥, 모세혈관)의 EC는 특정 기능을 가지고 있다는 점에 유의해야 합니다. 이들은 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에 의해 완전히 요약 될 수 없으며, 이는 혈관 내피 병태 생리학 5,6에 대한 연구에서 쉽게 이용 가능하고 널리 사용된다. 예를 들어, 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HLMVEC)는 백혈구 모집 및 축적을 조절하여 폐 염증에 중요한 역할을 합니다 4,7. 따라서 높은 충실도로 폐 염증을 재현하는 것을 목표로 하는 실험 환경에는 HLMVEC가 포함되어야 합니다. 반면에 EC 기능 장애는 여러 병리에서 관찰 될 수 있습니다. 따라서 환자의 EC는 질병의 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델을 구축하는 데 기본이 됩니다. 예를 들어, 낭포성 섬유증(CF)에 걸린 사람들의 이식된 폐에서 해부된 폐동맥(HPAEC)에서 EC 조각을 분리함으로써 이 질병에서 내피 기능 장애의 메커니즘을 밝힐 수 있었습니다 8,9.
따라서 질병 상태에서도 다양한 소스/기관으로부터 EC의 분리를 최적화하는 것을 목표로 하는 프로토콜은 특히 이러한 도구가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우 연구자에게 귀중한 연구 도구를 제공하는 데 필수적입니다. HLMVEC 및 HPAEC 격리 프로토콜은 이전에 보고되었습니다 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 모든 경우에, 폐 표본의 효소적 소화는 혼합 세포 집단을 초래했으며, 이는 임시 선택적 배지 및 자기 비드 또는 세포 분석 기반 세포 분류를 사용하여 정제되었습니다. 이러한 프로토콜의 추가 최적화는 EC 분리의 두 가지 주요 문제를 해결해야 합니다: (1) EC 복제 노화를 최소화하기 위해 가능한 한 빠른 배양 통로에서 해결되어야 하는 세포 및 조직 오염20; (2) 1차 EC 분리주의 낮은 수율.
이 연구는 HLMVEC 및 HPAEC의 고수율, 고순도 분리를 위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 쉽게 적용할 수 있으며 몇 단계로 거의 순수한 대혈관 및 미세혈관 EC를 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 병태생리학에서 혈관 내피 세포가 수행하는 다양한 역할은 이러한 세포를 체외 병인 및 약리학 연구에 없어서는 안될 도구로 만듭니다. 다른 혈관 부위/기관의 EC는 독특한 특징과 기능을 나타내기 때문에 관심 기관에서 건강하고 병든 EC를 사용할 수 있는 것이 연구 목적에 이상적입니다. 예를 들어, HLMVEC는 폐 염증에 대한 연구에 필수적입니다. 따라서 이러한 세포의 고수율, 고순도 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 이탈리아 대학 연구부(ex 60% 2021 및 2022)에서 RP에 대한 자금과 이탈리아 낭포성 섬유증 재단(FFC#23/2014) 및 이탈리아 보건부(L548/93)에서 MR에 대한 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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