Entwicklung von Leishmania-Speziesstämmen mit konstitutiver Expression von eGFP

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis- und L . donovani-Stämmen verwendet wird, die das Gen für eGFP als stabiles integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Transfizierte Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität in beiden Spezies wurden für die weitere Verwendung in Wirkstoff-Screening-Assays ausgewählt.

Abstract

Protozoen-Parasiten der Gattung Leishmania verursachen Leishmaniose , eine Krankheit mit unterschiedlichen klinischen Manifestationen, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen sind. Eine Infektion mit L. donovani kann zu einer tödlichen viszeralen Erkrankung führen. In Panama, Kolumbien und Costa Rica ist L. panamensis für die meisten gemeldeten Fälle von kutaner und mukokutaner Leishmaniose verantwortlich. Die Untersuchung einer großen Anzahl von Wirkstoffkandidaten mit den bisher verfügbaren Methoden ist recht schwierig, da sie sehr aufwendig sind, um die Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre Formen des Parasiten zu bewerten oder In-vivo-Assays durchzuführen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Generierung von L. panamensis – und L. donovani-Stämmen mit konstitutiver Expression des Gens, das für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) kodiert, das in den Locus integriert ist, der für 18S rRNA (ssu) kodiert. Das Gen, das für eGFP kodiert, wurde aus einem kommerziellen Vektor gewonnen und durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, um es anzureichern und Restriktionsstellen für die Enzyme BglII und KpnI hinzuzufügen. Das eGFP-Amplikon wurde durch Agarose-Gel-Reinigung isoliert, mit den Enzymen BglII und KpnI verdaut und in den Leishmania-Expressionsvektor pLEXSY-sat2.1 ligiert, der zuvor mit dem gleichen Enzymsatz verdaut worden war. Der Expressionsvektor mit dem klonierten Gen wurde in E. coli vermehrt, gereinigt und das Vorhandensein des Inserts mittels Kolonie-PCR verifiziert. Das gereinigte Plasmid wurde linearisiert und zur Transfektion von L. donovani – und L. panamensis-Parasiten verwendet. Die Integration des Gens wurde mittels PCR nachgewiesen. Die Expression des eGFP-Gens wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Fluoreszierende Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität wurden mittels Durchflusszytometrie ausgewählt.

Introduction

Protozoische Parasiten der Gattung Leishmania verursachen Leishmaniose, eine Krankheit mit einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen. Diese Krankheit ist in 98 Ländern verbreitet und ihre jährliche Inzidenz wird auf 0,9 bis 1,6 Millionen Fälle geschätzt¹. Leishmania-Arten, die für den Menschen pathogen sind, werden in zwei Untergattungen unterteilt, nämlich L. (Leishmanien) und L. (Viannia). Infektion mit einigen Arten, die zur L. Untergattungen (Leishmania), wie L. donovani und L. infantum, können zu viszeraler Leishmaniose (VL) führen, die unbehandelt tödlich verläuft². Arten, die zur L. (Viannia) sind mit den meisten Fällen von kutaner Leishmaniose (CL) und mukokutaner Leishmaniose (MCL) in Mittel- und Südamerika, insbesondere in Panama, Kolumbien und Costa Rica, assoziiert, wobei L. panamensis der wichtigste ätiologische Erreger dieser klinischen Erscheinungsformen ist ^3,4.

Die bestehende Chemotherapie gegen Leishmanien, die Medikamente wie fünfwertige Antimonia, Miltefosin und Amphotericin B umfasst, ist hochgiftig und teuer. Darüber hinaus sind in den letzten Jahrzehnten erhöhte Arzneimittelresistenzen zu den Faktoren hinzugekommen, die die wirksame Behandlung von Patienten weltweit beeinträchtigen⁵. Zwischen den Arten der Gattung Leishmania wurden erhebliche Unterschiede in Bezug auf die Arzneimittelempfindlichkeit nachgewiesen, insbesondere zwischen Arten der Neuen und der Alten Welt ^6,7. Aus diesen Gründen ist es notwendig, die Anstrengungen auf die Identifizierung und Entwicklung neuer Medikamente gegen Leishmanien zu richten, wobei den speziesspezifischen Ansätzen besondere Aufmerksamkeit zu widmen ist. Die Untersuchung großer Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten mit herkömmlichen Methoden ist recht schwierig, da diese Methoden sehr mühsam sind, um die Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre Amastigoten zu bewerten oder In-vivo-Experimente durchzuführen⁸; Daher war es notwendig, neue Techniken zu entwickeln, die diese Nachteile verringern, einschließlich der Implementierung von Reportergenen und der Entwicklung von phänotypischen High-Content-Screening-Assays⁹.

Die Verwendung von Reportergenen hat gezeigt, dass sie das Potenzial haben, die Effizienz des Wirkstoff-Screening-Prozesses zu erhöhen, da sie die Entwicklung von Hochdurchsatz- und In-vivo-Assays erleichtert. Rekombinante Leishmania-Parasiten, die mehrere Reportergene exprimieren, wurden von verschiedenen Forschungsgruppen erzeugt. Reportergene wie β-Galactosidase, β-Lactamase und Luciferase wurden in mehrere Leishmania-Spezies unter Verwendung episomaler Vektoren eingeführt und zeigen einen begrenzten Nutzen für das Wirkstoff-Screening in extra- und intrazellulären Formen des Parasiten 10,11,12,13,14,15. Diese Ansätze haben die Einschränkung, dass sie einen starken Selektionsdruck in der Kultur erfordern, um die Eliminierung des episomalen Konstrukts zu vermeiden, sowie die Verwendung zusätzlicher Reagenzien, um die Aktivität des Reportergens aufzudecken. Umgekehrt wurden das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Variante, das verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP), aufgrund ihrer Flexibilität und Sensitivität sowie der Möglichkeit, den Screening-Prozess mittels Durchflusszytometrie oder Fluorometrie zu automatisieren, bei der Generierung einer großen Anzahl transgener Leishmania-Stämme für In-vitro-Wirkstoff-Screening-Assays verwendet^{15, 16,17,18,19}. Trotz vielversprechender Ergebnisse waren die Kulturen dieser transgenen Stämme sehr heterogen in ihren Fluoreszenzwerten, da die Anzahl der Kopien des GFP-Gens nicht bei allen Parasiten gleich war. Darüber hinaus erforderte die Aufrechterhaltung der Fluoreszenz einen konstanten Selektionsdruck auf die Parasiten in der Kultur, da das GFP-Gen in einem episomalen Konstrukt eingeführt wurde.

Aus den oben genannten Gründen haben sich viele Bemühungen auf die Entwicklung neuer Methoden zur Herstellung stabiler rekombinanter Stämme konzentriert. Diese Bemühungen stützten sich hauptsächlich auf die Integration von Reportergenen in ribosomale Loci, wobei die höheren Transkriptionsraten ribosomaler Gene genutzt wurden²⁰. Es wurden Stämme von L. infantum und L. amazonensis erzeugt, die die Gene integriert haben, die für β-Galactocidase²¹, IFP 1.4, iRFP²² und tdTomato²³ kodieren, und sie wurden auf ihre Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening-Assays untersucht. Verschiedene Gruppen haben L. donovani-Stämme entwickelt, die GFP konstitutiv exprimieren, indem sie ihr kodierendes Gen durch homologe Rekombination in den ribosomalen RNA-Locus 18S (ssu-Locus) integrieren^24,25; Sie zeigten eine stabile und homogene GFP-Expression in der transfizierten Population, einschließlich intrazellulärer Amastigoten 24,25, und sie wurden erfolgreich in Wirkstoff-Screening-Assays implementiert^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 entwickelten Stämme von L. major und L. infantum, die GFP als integriertes Transgen exprimieren. Sie verwendeten den Integrationsvektor pLEXSY, der ursprünglich für die transgene Expression von Proteinen in einem System mit L. tarentolae als Wirt entwickelt wurde²⁸. Der pLEXSY-GFP-Vektor hat sich als sehr effizient für die Generierung verschiedener Leishmania-Stämme erwiesen, die GFP 24,25,27,29,30 konstitutiv exprimieren. Bei diesen Parasiten ist die Fluoreszenz homogen und bleibt in den intrazellulären Formen erhalten, so dass sie in Fußballenläsionen infizierter Mäuse nachgewiesen werden^{kann 27}.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis – und L. donovani-Stämmen verwendet wird, die das für eGFP kodierende Gen als integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Die durch diesen Prozess erzeugten Stämme werden in unserem Labor für die Durchführung von Medikamenten-Screening-Assays verwendet, die die potenzielle Anti-Leishmanie-Aktivität von Molekülen natürlichen und synthetischen Ursprungs bewerten.

Protocol

Um die Proben steril zu halten, sollten alle Schritte, die eine Parasitenkultur beinhalten, in einer Haube der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) oder gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften durchgeführt werden. Eine grafische Zusammenfassung dieses Protokolls finden Sie in Abbildung 1. Abbildung 1: Zusammenfas…

Representative Results

Nach dem Aufbau des pLEXSY-eGFP-Konstrukts und der Transformation kompetenter E. coli-Zellen erzeugen Kolonien, die das Konstrukt mit dem eGFP-Insert enthalten, nach Durchführung der in Abschnitt 1.2 beschriebenen Kolonie-PCR (Abbildung 3A) ein ca. 859 bp-Produkt. Der vollständige Aufschluss des gereinigten Plasmids aus positiven Kolonien unter Verwendung von SwaI sollte zwei charakteristische Fragmente in der Gelelektrophorese ergeben, ein 2,9 kbp-Fragment, das der Teil …

Discussion

Die Vor- und Nachteile verschiedener Reportergene wurden an mehreren Protozoen-Parasiten untersucht. Unter ihnen sind GFP und eGFP intrinsisch fluoreszierend und ermöglichen eine einfache Quantifizierung und Bildgebung. Die Fluoreszenzaktivität dieser Proteine kann mit minimaler Manipulation mittels Fluoreszenzmikroskopie, Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Es wurden nur wenige Studien zur Erzeugung von GFP-exprimierendem L durchgeführt. (Viannia)-Stämmen, trotz der nachgewi…

Materials

96 Well Microplates	Corning	CLS3340	Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose	Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme	New England BioLabs	R0144S	2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks	Corning	CLS430168	Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Not available
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Loading Buffer	Sigma-Aldrich	G2526	The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes	Bio-Rad	1652086	Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme	New England BioLabs	R3142S	4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar	Sigma-Aldrich	L3147	Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth	Sigma-Aldrich	L2542	Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Bio-Rad	1640300	Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride	Millipore	529552	Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014	for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme	New England BioLabs	R0604S	2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters	Corning	CLS431212	regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase	Promega	M1801	Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.