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Biology

zSpRY-ABE8e के साथ मानव आनुवंशिक रोग के ज़ेब्राफ़िश मॉडलिंग के लिए कुशल PAM-कम आधार संपादन

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64977
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 4, 1,2, 1,2
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई का उपयोग करके एक सटीक जेब्राफिश रोग मॉडल बनाने के लिए पीएएम सीमा के बिना कुशल एडेनिन बेस संपादन कैसे करें।

Abstract

CRISPR / Cas9 तकनीक ने मानव आनुवंशिक रोगों के मॉडलिंग, रोग रोगजनन का अध्ययन करने और दवा स्क्रीनिंग के लिए ज़ेबराफ़िश के मूल्य में वृद्धि की है, लेकिन प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) सीमाएं एकल-न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (एसएनवी) के कारण मानव आनुवंशिक विकारों के सटीक पशु मॉडल बनाने के लिए एक बड़ी बाधा हैं। अब तक, व्यापक पीएएम संगतता वाले कुछ स्पास 9 वेरिएंट ने जेब्राफिश में दक्षता दिखाई है। ज़ेब्राफ़िश में अनुकूलित एसपीआरवाई-मध्यस्थता एडेनिन बेस एडिटर (एबीई), जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई और सिंथेटिक रूप से संशोधित जीआरएनए के आवेदन ने पीएएम प्रतिबंध के बिना कुशल एडेनिन-गुआनिन बेस रूपांतरण को सक्षम किया है। यहां वर्णित जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई का उपयोग करके जेब्राफिश में पीएएम सीमा के बिना कुशल एडेनिन बेस संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल है। ज़ेबराफिश भ्रूण में zSpRY-ABE8e एमआरएनए और कृत्रिम रूप से संशोधित जीआरएनए के मिश्रण को इंजेक्ट करके, एक जेब्राफिश रोग मॉडल का निर्माण एक सटीक उत्परिवर्तन के साथ किया गया था जिसने टीएसआर 2 राइबोसोम परिपक्वता कारक (टीएसआर 2) की एक रोगजनक साइट का अनुकरण किया था। यह विधि रोग तंत्र और उपचार का अध्ययन करने के लिए सटीक रोग मॉडल की स्थापना के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करती है।

Introduction

एकल-न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (एसएनवी) जो गलत समझ या बकवास उत्परिवर्तन का कारण बनते हैं, मानव जीनोम1 में उत्परिवर्तन का सबसे आम स्रोत हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कोई विशेष एसएनवी रोगजनक है, और इसके रोगजनन पर प्रकाश डालने के लिए, सटीक पशु मॉडल की आवश्यकता होतीहै2. ज़ेबराफ़िश अच्छे मानव रोग मॉडल हैं, जो मनुष्यों के साथ उच्च स्तर की शारीरिक और आनुवंशिक होमोलॉजी, एक लघु विकास चक्र और मजबूत प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन करते हैं, जो रोगजनक विशेषताओं और तंत्र, साथ ही दवा स्क्रीनिंग3 में अनुसंधान के लिए फायदेमंद है।

जेब्राफिश4 सहित विभिन्न प्रजातियों के जीनोम संपादन में नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)/सीएएस 9 सिस्टम को व्यापक रूप से लागू किया गया है। जीआरएनए मार्गदर्शन के साथ, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली लक्ष्य स्थल पर डीएनए डबल-फंसे ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न कर सकती है, जो तब होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग के माध्यम से दाता डीएनए टेम्पलेट्स के साथ लक्ष्य साइट के पुनर्संयोजन के माध्यम से एकल-आधार प्रतिस्थापन की अनुमति देती है। हालांकि, इस आधार प्रतिस्थापन विधि की दक्षता काफी कम है क्योंकि सेलुलर डीएनए मरम्मत प्रक्रिया मुख्य रूप से गैर-समरूप अंत-जुड़ने (एनएचईजे) मार्ग द्वारा की जाती है, जो आमतौर पर सम्मिलन और विलोपन (इंडेल) उत्परिवर्तन5 के साथ होती है। सौभाग्य से, CRISPR / Cas9-आधारित एकल-आधार संपादन तकनीक आधार संपादकों का उपयोग करके इस समस्या को काफी कम करती है, जो DSB को प्रेरित किए बिना अधिक कुशल एकल-आधार संपादन सक्षम करती है। आधार संपादकों के दो प्रमुख वर्ग, एडेनिन बेस एडिटर (एबीई) और साइटोसिन बेस एडिटर (सीबीई), ए के लिए आधार प्रतिस्थापन संपादन को लागू करने के लिए विकसित किए गए हैं। T से G · C और C.G से T · ए, क्रमशः 6,7,8,9,10,11। इन चार प्रकार के आधार प्रतिस्थापन मानव रोगजनक वेरिएंट12 के 30% को कवर करते हैं। आधार संपादकों के दोनों वर्ग, जिनमें PMCDA1, BE सिस्टम, CBE4max, ABE7.10, और ABE8e शामिल हैं, को जेब्राफिश में काम करने की सूचना मिली है, जिसमें BE4max और ABE8e विशेष रूप से उच्च संपादन गतिविधि 13,14,15,16,17,18,19 प्राप्त करने की सूचना दी गई है।

स्टेफिलोकोकस ऑरियस, स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस और एस कैनिस सहित विभिन्न प्रजातियों के कैस 9 प्रोटीन को जेब्राफिश जीन संपादन में लागू किया गया है, जिसमें स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस कैस 9 (स्पास 9) का सबसे व्यापक रूप से20,21,22,23 उपयोग किया जा रहा है। हालांकि, SpCas9 केवल एक NGG प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) के साथ लक्ष्य साइटों को पहचान सकता है, जो इसकी संपादन योग्य सीमा को सीमित करता है और इसकेपरिणामस्वरूप रोगजनक साइट के पास कोई उपयुक्त अनुक्रम नहीं पाया जा सकता है। लक्ष्य सीमा का विस्तार करने के लिए, विभिन्न प्रकार के SpCas9 वेरिएंट को निर्देशित विकास और संरचना-निर्देशित डिजाइन के माध्यम से विभिन्न PAM को पहचानने के लिए इंजीनियर किया गया है। हालांकि, कुछ प्रकार जानवरों में प्रभावी हैं, विशेष रूप से ज़ेबराफ़िश में, जो एसएनवी से संबंधित रोग अनुसंधान25,26,27,28 में ज़ेबराफ़िश के आवेदन को सीमित करता है। हाल ही में, कम कड़े पीएएम प्रतिबंधों (एसपीजी के लिए एनजीएन और एनवाईएन की तुलना में एनआरएन के लिए उच्च वरीयता के साथ एसपीआरआई के लिए एनएनएन) के दो प्रकारों को मानव कोशिकाओं और पौधों 29,30,31,32 में उच्च संपादन गतिविधि प्रदर्शित करने की सूचना मिली है। इसके बाद, एसपीजी और एसपीआरवाई के साथ-साथ उनके कई मध्यस्थ आधार संपादकों, जैसे कि एसपीआरवाई-मध्यस्थता सीबीई और एसपीआरवाई-मध्यस्थता एबीई को भी जेब्राफिश में काम करने की सूचना मिली है, जो एसएनवी से संबंधित बीमारियों 18,33,34,35 के यांत्रिक अध्ययन और दवा स्क्रीनिंग में जेब्राफिश मॉडल के आवेदन को बढ़ाएगा।. इसके अलावा, आई-साइलेंस को एटीजी से जीटीजी या एसीजी36 में एबीई-मध्यस्थता स्टार्ट कोडन रूपांतरण के माध्यम से एक प्रभावी और सटीक जीन-नॉकआउट रणनीति के रूप में प्रस्तावित किया गया था। आई-साइलेंस रणनीति और एसपीआरवाई-मध्यस्थता आधार संपादक zSpRY-ABE8e का संयोजन रोग मॉडलिंग18 के लिए एक नई विधि प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आई-साइलेंस रणनीति का उपयोग करके टीएसआर 2 (एम 1 वी) मॉडल बनाने के लिए ज़ेबराफिश में zSpRY-ABE8e का उपयोग करके जीन संपादन कैसे करें। जेब्राफिश मॉडल में दिखाई देने वाली संपादन दक्षता और फेनोटाइप का मूल्यांकन और विश्लेषण किया गया था।

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Protocol

यह अध्ययन दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय की देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के सख्त अनुपालन में आयोजित किया गया था।

1. कृत्रिम रूप से संशोधित जीआरएनए और जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई एमआरएनए तैयार करना

  1. पिछले प्रकाशनों37,38 के अनुसार जीआरएनए डिजाइन करें।
    1. अधिमानतः NRN को PAM अनुक्रम के रूप में चुनें, क्योंकि zSpRY-ABE8e NYN PAM की तुलना में NRN PAM के लिए उच्च प्राथमिकता दिखाता है (जहां R A या G है, और Y, C या T है)18। सुनिश्चित करें कि लक्ष्य एडेनिन न्यूक्लियोटाइड अत्यधिक सक्रिय संपादन विंडो (प्रोटोस्पेसर के साथ तीसरे से नौवें न्यूक्लियोटाइड) में है।
  2. आदेश आसानसंपादित करें एसजीआरएनए (ईई जीआरएनए) दोनों सिरों पर 2'-ओ-मिथाइल-3'-फॉस्फोरोथियोएट (एमएस) के साथ संशोधित (चित्रा 1)।
    नोट: ईई जीआरएनए को आरएनएस-मुक्त पानी में भंग किया जाना चाहिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  3. zSpRY-ABE8e प्लास्मिड18 को रैखिक करें।
    1. 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर धातु स्नान में एक्सबीएआई एंजाइम (सामग्री की तालिका) के साथ प्लास्मिड के 6 μg को रैखिक करें।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए शुद्धिकरण किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके रैखिक प्लास्मिड को शुद्ध करें।
  4. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके एमआरएनए को स्थानांतरित करें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार टेम्पलेट के रूप में रैखिक प्लास्मिड के साथ zSpRY-ABE8e एमआरएनए को स्थानांतरित करें।
      नोट: एमआरएनए और जीआरएनए से जुड़े सभी कार्यों के लिए आरएनएस-मुक्त प्रयोगशाला आपूर्ति के उपयोग की आवश्यकता होती है।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एमआरएनए को शुद्ध करने के लिए आरएनए शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें।
    नोट: सलामी देने से पहले, इथेनॉल को साइटोटॉक्सिसिटी से बचने के लिए सुखाया जाना चाहिए, और एमआरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है।

2. माइक्रोइंजेक्शन ग्लास केशिकाओं की तैयारी

  1. माइक्रोपिपेट पुलर सिस्टम सेट करें, और कम से कम 30 मिनट के लिए प्रीहीट करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं (1 मिमी बाहरी व्यास और 0.58 मिमी आंतरिक व्यास के साथ) को पिघलाने के लिए आवश्यक गर्मी मूल्य निर्धारित करने के लिए एक रैंप परीक्षण चलाएं।
  3. किसी प्रोग्राम का चयन करें, और पैरामीटर मान दर्ज करने के लिए कुंजीपटल पर संख्या पर क्लिक करें. ग्लास केशिकाओं को खींचने के लिए निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें: गर्मी = रैंप परीक्षण मान, खिंचाव = 50, वेग = 100, समय = 50, और दबाव = 30।
  4. केशिका ट्यूब स्थापित करें, सुनिश्चित करें कि यह नाली में है। प्रोग्राम को चलाने के लिए PULL START/STOP दबाएँ ।
  5. खींची गई केशिकाओं को फोम में डालकर संरक्षित करें जिसमें अंतराल होता है, सुई को निलंबित रखा जाता है।

3. ज़ेबराफिश भ्रूण में zSpRY-ABE8e एमआरएनए और ईई जीआरएनए मिश्रण का माइक्रोइंजेक्शन।

  1. इंजेक्शन से पहले रात को प्रजनन टैंक स्थापित करें। एक डिवाइडर डालें, प्रत्येक टैंक में दो मादा ओं और एक नर एबी स्ट्रेन जेब्राफिश (3-18 महीने पुरानी) को रखें, और ढक्कन के साथ कवर करें। लिंग भेद के लिए पिछलेप्रकाशनों को देखें।
    नोट: अधिक भ्रूण प्राप्त करने के लिए, उन मछलियों का चयन करें जो कम से कम 1 सप्ताह से प्रजनन नहीं कर रही हैं।
  2. इंजेक्शन से पहले अगली सुबह, बर्फ पर zSpRY-ABE8e mRNA और EE gRNA को पिघलाएं। एमआरएनए और जीआरएनए को क्रमशः 400 एनजी / μL और 200 ng / μL की अंतिम सांद्रता में मिलाएं।
    1. RNase-मुक्त युक्तियों और ट्यूबों का उपयोग करके बर्फ पर पूरी प्रक्रिया करें, और दस्ताने के साथ संभालें।
  3. वायवीय माइक्रोइंजेक्टर कॉन्फ़िगर करें। एयर पंप के आंशिक दबाव वाल्व को बंद करें और पहले मुख्य वाल्व खोलें, गैस सिलेंडर को अनस्क्रू करें, और आंशिक दबाव वाल्व के दबाव को 0.2 एमपीए / 29 पीएसआई तक समायोजित करें।
    1. वायवीय माइक्रोइंजेक्टर चालू करें, मोड को टाइमर पर सेट करें, और प्रारंभिक पैरामीटर दबाव मान को 20.0 पीएसआई और टाइमर मान को 0.040 एस में समायोजित करें।
  4. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत खींची गई कांच की केशिकाओं की सुइयों को सावधानीपूर्वक तोड़ने के लिए ठीक बल का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोरियन और अंडे के छेदने की सुविधा के लिए सुइयों को एक कोण पर काटा जाता है।
    नोट: सुई का ब्रेक पॉइंट सही जगह पर होना चाहिए और अंडे को नुकसान को कम करने के लिए अंडे को छेदने के लिए पर्याप्त मजबूत होना चाहिए।
  5. केशिका में बुलबुले से बचने के लिए, माइक्रोलोडर पिपेट टिप का उपयोग करके ग्लास केशिका की नोक पर zSpRY-ABE8e mRNA और जीआरएनए के मिश्रण को जोड़ें। सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करें, और इंजेक्टर के दबाव और टाइमर मान को कॉन्फ़िगर करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि माइक्रोकैप का उपयोग करके प्रति इंजेक्शन 2 एनएल मिश्रण का उत्पादन किया जाता है।
  6. प्रजनन टैंक के डिवाइडर को अनप्लग करें, और मछली को 10-15 मिनट के लिए प्रजनन करने की अनुमति दें। एक छन्नी का उपयोग करके अंडे एकत्र करें, और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अंडे के सेल चरण और गुणवत्ता की जांच करें। संपादन दक्षता में सुधार के लिए इंजेक्शन के लिए एकल-कोशिका अवस्था में अंडे का चयन करें।
  7. अंडे को 1.5% अगारोस इंजेक्शन प्लेट पर लाइन करें, और संपादन दक्षता में सुधार के लिए माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण के जर्दी नहीं, बल्कि सेल में मिश्रण के 2 एनएल इंजेक्ट करें। नियंत्रण समूह के रूप में कम से कम 15 अंडे रखें।
  8. पेट्री व्यंजनों में अंडे इकट्ठा करने के लिए 1x E3 बफर का उपयोग करें, और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें। मृत अंडे को हटा दें, और निषेचन (एचपीएफ) के 48 घंटे बाद तक हर 12 घंटे में कल्चर बफर बदलें।

4. संपादन के साथ आधार संपादन की दक्षता विश्लेषण

  1. 48 एचपीएफ पर, छह यादृच्छिक रूप से चयनित इंजेक्शन भ्रूण और छह यादृच्छिक रूप से चयनित नियंत्रण भ्रूण के तीन पूल क्रमशः पीसीआर ट्यूबों में एकत्र करें। अवशिष्ट ई 3 बफर को एस्पिरेट करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  2. पीसीआर ट्यूबों में 50 mM NaOH के 40 μL जोड़ें। ट्यूबों को 20 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर धातु स्नान में रखें, और फिर 15 सेकंड के लिए भंवर।
  3. 1 M Tris के 4 μL जोड़ें · एनओएच को बेअसर करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में एचसीएल (पीएच 8.0)। ट्यूब की दीवार से बूंदों को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 10 सेकंड के लिए 2,000 x g पर संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को नए पीसीआर ट्यूबों में इकट्ठा करें, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. जीआरएनए लक्ष्य साइटों के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम उपयुक्त प्राइमरों को डिजाइन करें। 50 μL वॉल्यूम की पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए टेम्पलेट के रूप में उपरोक्त सुपरनैटेंट के 1 μL का उपयोग करें। इस अध्ययन में पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों को पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है।
  5. सही और विशिष्ट बैंड सुनिश्चित करने के लिए एक डीएनए एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन करें, इसके बाद सेंगर अनुक्रमण जैसा कि पहले वर्णित40 है।
  6. संपादन (1.0.10) प्रोग्राम41 के साथ सेंगर अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करें।
    1. अनुक्रमण फ़ाइल (ab1 स्वरूप) को "अपलोड .ab1 फ़ाइल" बॉक्स में अपलोड करें।
    2. "जीआरएनए अनुक्रम दर्ज करें" बॉक्स में 5'-3′ अभिविन्यास में 20 बीपी जीआरएनए अनुक्रम दर्ज करें।
    3. अनुक्रमण फ़ाइल (ab1 प्रारूप) खोलें, और उन आधार स्थितियों की पुष्टि करें जहां 20 bp gRNA अनुक्रम शुरू और समाप्त होता है। "5' प्रारंभ" और "3' अंत" बक्से में संबंधित आधार स्थिति दर्ज करें।
    4. आधार संपादन दक्षता प्राप्त करने के लिए पूर्वानुमानित संपादन पर क्लिक करें। अव्यवस्थित चोटियों या इंडेल से बचने के लिए जीआरएनए लक्ष्य अनुक्रम के पास अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता की जांच करें।
      नोट: सामान्य तौर पर, पीसीआर एनीलिंग तापमान को समायोजित करके अव्यवस्थित चोटियों को प्रभावी ढंग से हटाया जा सकता है।

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Representative Results

टीएसआर 2 के उत्परिवर्तन से डायमंड ब्लैकफैन एनीमिया (डीबीए) 42 होने की सूचना मिली है। यहां, आई-साइलेंस रणनीति का उपयोग करके टीएसआर 2 (एम 1 वी) उत्परिवर्तन के साथ एक डीबीए जेब्राफिश मॉडल का निर्माण किया गया था। ज़ेबराफ़िश टीएसआर 2 के स्टार्ट कोडन के एडेनिन को सफलतापूर्वक जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई (चित्रा 3) का उपयोग करके गुआनिन में परिवर्तित किया गया था।

सेंगर अनुक्रमण परिणामों के एडिटआर विश्लेषण से पता चला है कि टीएसआर 2 स्टार्ट कोडन (चित्रा 4) के एडेनिन बेस पर ए / जी ओवरलैप था।

एफ 0 संस्थापकों को पहले से उत्पन्न टीएसआर 2 विषम उत्परिवर्ती वयस्क के साथ जोड़े जाने के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत निषेचन (डीपीएफ) के 2 दिनों के बाद भ्रूण फेनोटाइप देखे गए। कई भ्रूणों ने नियंत्रण की तुलना में छोटी आंखों के फेनोटाइप और सूजन वाले पेरिकार्डियम का प्रदर्शन किया (चित्रा 5)। भ्रूण को 0.03% ट्राइकेन के साथ एनेस्थेटाइज किया गया, 4% मिथाइलसेल्यूलोज पर तय किया गया, और फोटो खिंचवाया गया।

Figure 1
चित्रा 1: ईई जीआरएनए के अनुक्रम और द्वितीयक संरचना का योजनाबद्ध आरेख जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई प्रोटीन में लोड किया गया है। रासायनिक रूप से संशोधित न्यूक्लियोटाइड ्स को काले सितारों के साथ लेबल किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: zSpRY-ABE8e mRNA संरचना का योजनाबद्ध आरेख जिसमें कोडन-अनुकूलित Tada8e (zTada8e) और कोडन-अनुकूलित SpRYCas9 (zSpRYCas9) शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: zSpRY-ABE8e का उपयोग करके ज़ेबराफ़िश tsr2 (M1V) उत्परिवर्तन का योजनाबद्ध आरेख। पीएएम अनुक्रमों को लाल रंग में हाइलाइट किया गया है, संपादित आधारों को नीले रंग में हाइलाइट किया गया है, और लक्षित अमीनो एसिड बोल्ड में हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई का उपयोग करके ज़ेबराफिश टीएसआर 2 (एम 1 वी) उत्परिवर्तन के क्रोमैटोग्राम परिणामों को अनुक्रमित करना। एक्स-अक्ष आधार अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है, वाई-अक्ष चोटी की ऊंचाई का प्रतिनिधित्व करता है, और संपादित आधार को लाल तीर के साथ इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: नियंत्रण की तुलना में 2 डीपीएफ पर टीएसआर 2 (एम 1 वी) भ्रूण का फेनोटाइप। (ए, सी) 2 डीपीएफ पर (ए, बी) जंगली प्रकार एबी जेब्राफिश और (सी, डी) टीएसआर 2 (एम 1 वी) भ्रूण का पार्श्व दृश्य और (बी, डी) पृष्ठीय दृश्य। सी में लाल तीर पेरिकार्डियल सूजन को इंगित करता है। लाल फ्रेम और व्यास आंख के आकार को दर्शाते हैं। स्केल बार: 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल बेस एडिटर zSpRY-ABE8e का उपयोग करके एक ज़ेबराफ़िश रोग मॉडल के निर्माण का वर्णन करता है। आधार प्रतिस्थापन के लिए पारंपरिक एचडीआर मार्ग की तुलना में, यह प्रोटोकॉल अधिक कुशल आधार संपादन प्राप्त कर सकता है और इंडेल की घटना को कम कर सकता है। इसी समय, इस प्रोटोकॉल में जेब्राफिश में हाल ही में प्रस्तावित आई-साइलेंस जीन-नॉकआउट रणनीति को लागू करना शामिल है। एक साथ लिया गया, zSpRY-ABE8e रोग अनुसंधान में जेब्राफिश मॉडल के आवेदन को बढ़ाएगा।

CRISPR / Cas9 सिस्टम में ऑफ-टारगेट प्रभाव एक आम समस्या है। PAM-कम प्रतिबंध को ध्यान में रखते हुए, zSpRY-ABE8e का ऑफ-टारगेट प्रभाव अधिक हो सकता है, भले ही टीएसआर 2 लक्ष्यीकरण18 सहित पिछले अध्ययन में कोई महत्वपूर्ण ऑफ-टारगेट नहीं पाया गया हो। सौभाग्य से, इस समस्या से सख्त जीआरएनए डिजाइन मानकों से बचा जा सकता है, जो यह सुनिश्चित करते हैं कि केवल एक जीनोम अनुक्रम पीएएम के साथ जीआरएनए से मेल खाता है और अनुमानित ऑफ-टारगेट साइटों की कुल संख्या को न्यूनतम रखता है। इसके अतिरिक्त, एक अध्ययन से पता चला है कि राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) और जीआरएनए का इंजेक्शन एमआरएनए और जीआरएनए43 के इंजेक्शन की तुलना में ऑफ-टारगेट संभावना को कम करता है। इसके अलावा, जीआरएनए और कैस 9 का संशोधन ऑफ-टारगेट प्रभाव44,45 को भी कम कर सकता है। ज़ेबराफ़िश में, प्रजनन की कई पीढ़ियों को लक्ष्य फेनोटाइप ्स के लिए भी जांच की जा सकती है ताकि कम ऑफ-टारगेट प्रभाव वाले पशु मॉडल प्राप्त किए जा सकें।

इस प्रोटोकॉल में अभी भी कुछ सीमाएं हैं। यद्यपि zSpRY-ABE8e में कोई PAM प्रतिबंध नहीं है, फिर भी यह PAM वरीयता प्रदर्शित करता है, NRN जेब्राफिश में NYN को प्राथमिकता देता है। इसके अलावा, एबीई केवल दो प्रकार के आधार प्रतिस्थापन को लागू कर सकता है, जिसका अर्थ है कि यह केवल आंशिक मॉडल के निर्माण पर लागू होता है। जेब्राफिश में शेष आधार प्रतिस्थापन को लागू करने के लिए अभी भी अधिक आधार संपादकों को विकसित करने की आवश्यकता है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल ज़ेबराफ़िश में zSpRY-ABE8e एकल आधार संपादक के उपयोग के लिए विस्तृत मार्गदर्शन प्रदान करता है। यह सटीक ज़ेब्राफ़िश रोग मॉडल बनाने के लिए एक व्यवहार्य और कुशल विधि प्रदान करता है, जो एसएनवी से संबंधित बीमारियों के रोगजनन और उपचार के अध्ययन में ज़ेबराफ़िश मॉडल के आवेदन का विस्तार करता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि के मसौदे के अंग्रेजी पाठ को संपादित करने के लिए लिवेन बियांजी (एडांज) से बारबरा गार्बर्स, पीएचडी को धन्यवाद देते हैं। इस काम को गुआंग्डोंग प्रांत के की-एरिया रिसर्च एंड डेवलपमेंट प्रोग्राम (2019बी030335001), चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2019वाईएफई0106700), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32070819, 31970782), और जलीय आर्थिक जानवरों के लिए रोगजनक जीवविज्ञान और महामारी विज्ञान के गुआंग्डोंग प्रांतीय कुंजी प्रयोगशाला के अनुसंधान निधि कार्यक्रम (पीबीईए 2020वाईबी05) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539 1.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries  Harvard Apparatus BS4 30-0016
Cell culture dishes  Falcon 351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit Vazyme C115 Kit for Infusion clone 
Codon optimization service Sangon Biotech
Drummond Microcaps Drummond Microcaps P1299-1PAK Length:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA service GenScript
Fine Forceps Fine Scientific Instrument 11254-20 Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller  Stutter Instrument P-97 Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMix Genstar A033-101 Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate box TENLIN PRX-1000A Used to culture zebrafish embryos
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512 Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips  Eppendorf 5242956003
mMACHINE kit 
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 Vazyme C214-01 Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic Microinjector ZGene Biotech ZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9 Addgene 46757
RNeasy FFPE kit  Qiagen 73504 Kit for RNA purification
Sanger Sequencing service Sangon Biotech
Sodium hydroxide, granular Sangon A100173-0500 NaOH used for genome extraction
Stereo Microscope Olympus  SZX10 Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo Microscope CNOPTEC SZ650
T3 mMESSAGE Ambion AM1348 Kit for in vitro transcription 
TIANprep Mini Plasmid Kit TIANGEN DP103-03 Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification Kit TIANGEN DP203-02 Kit for purification for linearized plasmid
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sangon A600194-0500 Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaI New England Biolabs R0145S Restriction endonuclease used for plasmid linearization

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References

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वापसी अंक 192
zSpRY-ABE8e के साथ मानव आनुवंशिक रोग के ज़ेब्राफ़िश मॉडलिंग के लिए कुशल PAM-कम आधार संपादन
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Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y.,… More

Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y., Fei, J. F., Qin, W., Liu, Y. Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e. J. Vis. Exp. (192), e64977, doi:10.3791/64977 (2023).

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