Thrombose artérielle induite par le chlorure ferrique et prélèvement d’échantillons pour analyse en microscopie électronique 3D
Summary
Le présent protocole décrit comment utiliser une lésion médiée par FeCl3 pour induire une thrombose artérielle, et comment collecter et préparer des échantillons de lésions artérielles à différents stades de la thrombose pour l’analyse en microscopie électronique.
Abstract
Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde. La thrombose aberrante est une caractéristique commune des affections systémiques comme le diabète et l’obésité, et des maladies inflammatoires chroniques comme l’athérosclérose, le cancer et les maladies auto-immunes. En cas de lésion vasculaire, le système de coagulation, les plaquettes et l’endothélium agissent généralement de manière orchestrée pour prévenir les saignements en formant un caillot sur le site de la blessure. Les anomalies de ce processus entraînent soit des saignements excessifs, soit une thrombose incontrôlée / une activité antithrombotique insuffisante, ce qui se traduit par une occlusion des vaisseaux et ses séquelles. Le modèle de lésion carotidienne induite par FeCl3 est un outil précieux pour sonder comment la thrombose commence et progresse in vivo. Ce modèle implique des dommages endothéliaux/dénudation et la formation subséquente de caillots sur le site blessé. Il fournit un test quantitatif très sensible pour surveiller les dommages vasculaires et la formation de caillots en réponse à différents degrés de dommages vasculaires. Une fois optimisée, cette technique standard peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la thrombose, ainsi que les changements ultrastructuraux dans les plaquettes dans un thrombus en croissance. Ce test est également utile pour étudier l’efficacité des agents antithrombotiques et antiplaquettaires. Cet article explique comment initier et surveiller la thrombose artérielle induite par FeCl3 et comment prélever des échantillons pour analyse par microscopie électronique.
Introduction
La thrombose est la formation d’un caillot sanguin qui bloque partiellement ou complètement un vaisseau sanguin, entravant la circulation naturelle du sang. Cela conduit à des événements cardiovasculaires graves et mortels, tels que les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux. Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité, et causent un décès sur quatre dans le monde 1,2,3. Bien que la thrombose se manifeste par un dysfonctionnement du système vasculaire, elle pourrait être le résultat d’une infection microbienne ou virale sous-jacente, d’un trouble immunitaire, d’une tumeur maligne ou d’une affection métabolique. La circulation sanguine est maintenue par l’interaction complexe entre divers composants du système vasculaire, y compris les cellules endothéliales, les globules rouges / blancs, les plaquettes et les facteurs de coagulation4. En cas de lésion vasculaire, les plaquettes interagissent avec les protéines adhésives de la matrice sous-endothéliale et libèrent leur contenu granulaire, ce qui recrute plus de plaquettes5. Parallèlement, la cascade de coagulation est activée, conduisant à la formation et au dépôt de fibrine. En fin de compte, un caillot se forme, contenant des plaquettes et des globules rouges piégés dans un maillage de fibrine6. Bien que des médicaments antiplaquettaires et anticoagulants soient disponibles pour moduler la thrombose, les saignements parasites demeurent une préoccupation majeure avec ces thérapies, nécessitant un réglage fin des dosages et des combinaisons de ces médicaments. Ainsi, il est toujours urgent de découvrir de nouveaux médicaments anti-thrombotiques7.
La thrombose est étudiée à l’aide de plusieurs méthodes pour infliger des lésions vasculaires: mécanique (ligature des vaisseaux), thermique (lésion au laser) et chimique (application FeCl3 / Rose Bengal). La nature de la thrombose varie en fonction de l’emplacement (artériel vs veineux), de la méthode ou de l’étendue de la blessure. Parmi tous ces types, les lésions vasculaires induites par FeCl3 sont la méthode la plus utilisée. Il a été employé chez les souris, les rats, les lapins, les cobayes et les chiens 8,9,10,11,12. La méthode est relativement simple, facile à utiliser et, si les principaux paramètres sont normalisés, elle est sensible et reproductible dans divers systèmes vasculaires (p. ex. artères [carotides et fémorales], veines [jugulaires] et artérioles [cremaster et mésentérique]) (tableau supplémentaire 1).
Ce modèle peut également être utilisé pour approfondir notre compréhension de la mécanique et de la morphologie de la formation des caillots. Cette technique offre uniquement l’avantage d’arrêter la thrombose à différents points de débit, pour étudier les étapes intermédiaires du processus avant qu’il ne devienne occlusif. Les progrès récents de la recherche sur la thrombose ont utilisé ce modèle pour attirer l’attention sur les méthodes non pharmacologiques de thrombolyse13 ou l’administration non invasive d’agents antithrombotiques et/ou fibrinolytiques14,15. Plusieurs groupes ont montré que, lorsque les membranes plaquettaires sont recouvertes de ces traitements, les médicaments peuvent être activés par stimulation thermique pour cibler les caillots16. Les techniques décrites ici peuvent être utiles à des études telles que la validation de leurs résultats au niveau plaquettaire unique. Dans ce manuscrit, le protocole 1 décrit la procédure de base de lésion vasculaire médiée par FeCl3, tandis que le protocole 2 décrit la méthode de collecte et de fixation de l’échantillon de lésion vasculaire pour une analyse plus approfondie par microscopie électronique.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’application topique de FeCl3 au système vasculaire pour induire la thrombose est une technique largement utilisée et a joué un rôle déterminant dans l’établissement des rôles de divers récepteurs plaquettaires, des voies de signalisation des ligands et de leurs inhibiteurs20,21,22,23. Le mécanisme par lequel FeCl3 provoque la thrombose est multiforme; Aupara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les membres du Laboratoire Whiteheart pour leur lecture attentive de ce manuscrit. Le travail a été soutenu par des subventions du NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 et HL150818), et une bourse du mérite du ministère des Anciens Combattants à S.W.W., R01 HL 155519 à B.S., et une subvention du programme intra-muros NIBIB à R.D.L.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
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