Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה וזולה המשתמשת במדיה נוזלית כדי להעריך את ההשפעות של רעלים כימיים על הכדאיות של Drosophila melanogaster בוגר.
Abstract
תעשיות אנושיות מייצרות מאות אלפי כימיקלים, שרבים מהם לא נחקרו כראוי לבטיחות סביבתית או השפעות על בריאות האדם. מחסור זה במידע בטיחות כימי מחמיר על ידי שיטות הבדיקה הנוכחיות ביונקים שהן יקרות, עתירות עבודה וגוזלות זמן. לאחרונה, מדענים ורגולטורים עובדים על פיתוח מתודולוגיות גישה חדשות (NAMs) לבדיקות בטיחות כימיות שהן זולות יותר, מהירות יותר ומפחיתות את סבלם של בעלי חיים. אחד ה-NAMs המרכזיים שהופיעו הוא השימוש באורגניזמים חסרי חוליות כתחליף למודלים של יונקים כדי להבהיר דרכי פעולה כימיות שמורות במינים רחוקים, כולל בני אדם. כדי לקדם מאמצים אלה, אנו מתארים כאן שיטה המשתמשת בזבוב הפירות, Drosophila melanogaster, כדי להעריך את הבטיחות הכימית. הפרוטוקול מתאר הליך פשוט, מהיר וזול למדידת הכדאיות והתנהגות ההאכלה של זבובים בוגרים חשופים. בנוסף, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות ליצירת דגימות לגישות גנומיות ומטבוליות. בסך הכל, הפרוטוקול מייצג צעד חשוב קדימה בביסוס דרוזופילה כמודל סטנדרטי לשימוש בטוקסיקולוגיה מדויקת.
Introduction
בני אדם נחשפים כל הזמן לכימיקלים ממגוון מקורות, כולל אוויר1, מזון2, מים3,4, תרופות5, חומרי ניקוי6, מוצרי טיפוח אישי 7, כימיקלים תעשייתיים 7 וחומרי בניין 7. יתר על כן, אלפי כימיקלים חדשים מוצגים מדי שנה8, שרבים מהם אינם נבדקים כראוי לבריאות ובטיחות הסביבה. היעדר בדיקות בטיחות כימיות מספקות נובע בחלקו מהסתמכות יתר על מודלים של יונקים, כגון עכברים וחולדות. בעוד מודלים כאלה מכרסמים הם אינפורמטיביים, בדיקות בטיחות כימיות במערכות אלה הן יקרות, גוזלות זמן, ולעתים קרובות גורמות רמות בלתי מתקבלות על הדעת של סבל לחיית הניסוי9.
הנטל הכספי והאתי הקשור לבדיקות בטיחות כימיות של יונקים, כמו גם האופי הגוזל זמן של מחקרי יונקים, הם גורמים מרכזיים התורמים למיעוט הנתונים סביב כימיקלים חדשים. כדי להתמודד עם בעיה זו, הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב (EPA), סוכנות הכימיקלים האירופית (ECHA), Health Canada וסוכנויות אחרות מיישמות אמצעים המשלבים מתודולוגיות גישה חדשות (NAMs) במסגרות רגולטוריות10, ובכך מציבים את המדיניות בצפון אמריקה ובאירופה בקנה אחד עם היעדים הבינלאומיים להחליף, להפחית ולחדד את השימוש בבעלי חיים (עקרון 3Rs)11, 12,13,14. NAMs מקיפים מגוון של בדיקות המבוססות בעיקר על מודלים במבחנה ובסיליקו המספקים הבנה מכניסטית של רעילות כימית במקום לצפות במצוקות הנגרמות למיני ניסויים של יונקים, ובכך מגדילים את קצב הפקת הנתונים להערכת סיכונים כימיים תוך הפקת תפוקות נאמנות גבוהות15. עם זאת, שיטות אלה עדיין לא הוכחו כמגינות מפני רעילות מערכתית, כולל שיבוש תהליכים ביולוגיים חיוניים הכוללים תקשורת בין איברים ואיתות אנדוקריני. יתר על כן, הם אינם יכולים להסביר את ההצטברות הביולוגית של כימיקלים בתוך רקמות ספציפיות, את היכולת של תרכובות בודדות להיספג ולהפריש, ואת יחסי הגומלין בין התנהגות וחשיפה כימית.
בשל המגבלות של מודלים חוץ גופיים וחישוביים, השימוש המוצלח ב-NAMs כדי להפחית או להחליף מודלים של יונקים צריך לכלול גם מודלים של חסרי חוליות in vivo, כגון זבוב הפירות, Drosophila melanogaster. מחקרים קודמים בזבוב הראו כי אורגניזם זה מתאים היטב לחקר המסלולים הגנטיים השמורים המגנים על תאי בעלי חיים מפני מולקולות רעילות 16,17,18,19,20,21,22. יתר על כן, הזבוב מראה דמיון גנטי יוצא דופן לבני אדם, כולל הומולוגים פונקציונליים ליותר מ -65% מהמחלות האנושיות 23,24,25 ושימור גדול עוד יותר של מסלולים תפקודיים חשובים 26. תכונות אלה, בשילוב עם מחזור החיים הקצר יחסית שלהן, עלות תחזוקה נמוכה ותגובות התנהגותיות שניתן להבחין בהן בקלות, הופכות את דרוזופילה למתאימה לשימוש כמודל טוקסיקולוגי27,28,29,30. יתר על כן, לזבובים יש תפוקה גבוהה בהרבה מאשר מודלים של מכרסמים והם לוכדים השפעות על חילוף חומרים, פיזיולוגיה ואיתות הורמונלי שאינן ניתנות לזיהוי בקלות על ידי NAMs אחרים שאינם אורגניזם9.
הפרוטוקול המתואר כאן מייצג מסגרת לבדיקת ההשפעות של חשיפה כימית על דרוזופילה בוגרת. השיטה מתוכננת להיות יעילה, זולה וניתנת לשחזור, תוך מזעור הזמן שעל החוקרים להיות במגע עם חומר הניסוי הכימי ולהתאים את איסוף הדגימות למטבולומיקה ולגישות אומיקס אחרות. הפרוטוקול מותאם לבדיקת כימיקל יחיד בכל ניסוי, אך יכול להתאים בקלות לפרמטרים ניסיוניים אחרים, כגון ממסים מגוונים או שילובים של כימיקלים.
Protocol
הערה: יש ללבוש כפפות ניטריל עבור כל השלבים בפרוטוקול זה. יש ללבוש חלוק מעבדה, מגן עיניים ו/או מכונות הנשמה, בהתאם לגיליונות נתוני הבטיחות עבור כל כימיקל מוערך.
1. הכנת בקבוקון ותא לחות
הערה: ניתן להשלים את שלבים 1.1-1.5 בכל עת לפני תחילת קטעי הניסוי האחרים. יש ללבוש כפפות ניטריל בכל עת במהלך הכנת הבקבוקון כדי למנוע זיהום.
- ערמו ארבעה גיליונות של נייר כרומטוגרפיה תאית דרגה 1 (ראו טבלת חומרים) וחתכו אותם ל-2 ברצועות רחבות. נקב את תוספות נייר הפילטר בצורת פרח באמצעות ניקוב נייר בגודל 1.5 אינץ' המכיל מת בצורת פרח.
- השתמש בדיבל עץ ללא לכה בגודל 22 מ"מ x 220 מ"מ כדי לדחוף את נייר הסינון לתחתית בקבוקון פוליפרופילן בקוטר 28.5 מ"מ. ודא שערימת נייר הסינון ממוקמת היטב בתחתית הבקבוקון.
- אחסנו את הבקבוקונים המוכנים במגשי פלסטיק או קרטון והניחו את המגשים בשקיות ניילון גדולות (~ 280 מ"מ x 240 מ"מ) עד לשימוש.
- בנה תא לחות על ידי חיתוך חור בגודל 120 מ"מ x 280 מ"מ במכסה הפלסטיק של גיגית פלסטיק בגודל 606.24 מ"מ x 225.42 מ"מ x 403.22 מ"מ (ראה טבלת חומרים). הדביקו את הרשת מעל החור כדי לאפשר זרימת אוויר.
- חתכו קטע מרשת הפלסטיק מלוחות תאורת תקרה עם תריסים (במקור 610 מ"מ x 1220 מ"מ) כדי להתאים לתחתית אמבט הפלסטיק המשמש בשלב 1.4.
הערה: ניתן להשתמש במגוון אמבטיות פלסטיק שונות וחומרי רשת פלסטיק/מתכת לבניית תא לחות.
2. גידול זבובים
- התחל תרביות של זבובים בוגרים (מינימום 30 מבוגרים) בבקבוקי חלב מזכוכית המכילים מדיה סטנדרטית של Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)31. סגרו את הבקבוקים עם תקע קרניים עטוף במגבון משימה עדין. אל תצטופפו בבקבוקים.
הערה: מספר הבקבוקים הנדרשים תלוי במספר החשיפות הכימיות המתבצעות ובגנוטיפ של זן הבדיקה. בדרך כלל, כמה מאות זבובים ניתן להשיג מבקבוק יחיד בעת שימוש במלאי חזק ו fecund. הבדיקה הסטנדרטית משתמשת בזבובי בר מסוג Oregon-R (מלאי BDSC #2057), אך ניתן להשתמש בכל גנוטיפ(ים) מעניינים עם פרוטוקול זה. זכור כי גנוטיפים פגומים עם צואה נמוכה ו / או כדאיות דורשים תרביות בקבוק מוגברת. - דגרו על מגשי בקבוקי התרבית בטמפרטורה של 25°C עם לחות של כ-60% ומחזור אור:כהה של 12:12 שעות עד לצפייה בכוכב הזחל השלישי או בשלבי הגלמים המוקדמים. שלב זה ניתן לזיהוי על ידי נוכחות הזחלים המשוטטים בצידי הבקבוק והופעת הגלמים על דפנות הבקבוק.
הערה: טפל בזבובים רק במהלך תקופת הדלקת האורות של מחזור האור:חושך של 12:12 שעות. עבור מלאי חזק, בקבוקים מגיעים לשלב זה לאחר 3-4 ימים בתנאים המתוארים.- הסר זבובים בוגרים וקבע את נזילות התקשורת. אם המדיה זורמת לאורך דופן הבקבוק כשהיא הפוכה, המדיום נוזלי מדי. הכניסו מגבון משימה עדין או כדור קרניים לתחתית הבקבוק כדי למצק את מזון הזבובים.
- כאשר הזבובים מתחילים להיסגר, נקו את כל הבוגרים מהבקבוקים ואפשרו לגלמים להמשיך להיסגר במשך 48 שעות. בשלב זה, כל מבוגר ששוחרר מבקבוקי התרבית יכול להיות מועבר לבקבוקים חדשים כדי להפיץ את המלאי (ראה שלב 2.1) או לזרוק.
- העברת זבובים שנסגרים בתקופה של 48 שעות לבקבוקים חדשים המכילים מדיה BDSC סטנדרטית. גיל 3 ימים.
הערה: המבוגרים בבקבוקים אלה הם בני 3-5 ימים וניתן להשתמש בהם בניסויי קטלניות והאכלה. הבקבוקים המשמשים ליישון זבובים בוגרים יכילו ביצים וזחלים. כתוצאה מכך, בקבוקים אלה יכולים לשמש להפצת הדור הבא של הזבובים.
3. הכנת זבובים לחשיפה כימית
- הרדימו זבובים בני 5-7 ימים עם CO2. מיין את הזבובים המורדמים לפי מין באמצעות איברי המין שלהם. לסיוע בהרדמה ובמין זבובים, ראו הערה28.
- הכניסו קבוצות של 20 זבובים זכרים או 20 נקבות לבקבוקונים המכילים מדיה סטנדרטית של BDSC. סגור את הבקבוקון עם תקע קרניים ואחסן את בקבוקוני הזכר והנקבה בנפרד. סמנו את הבקבוקונים המכילים נקבות זבובים בפס. השאירו את הבקבוקונים עם זבובים זכרים לא מסומנים כדי למנוע ערבוב מינים בטעות.
הערה: מספר הבקבוקונים שיש להכין בשלב 3.2 מוכתב על ידי גודל ניסויי החשיפה. כפי שמתואר בשלבים 5.3 ו-5.6, ניסוי טיפוסי למציאת טווח עבור כימיקל בדיקה יחיד דורש מינימום של 40 בקבוקונים של זכרים ו-40 בקבוקונים של נקבות. ניסוי סטנדרטי של עקומת מנה-תגובה, המתואר בשלבים 7.4 ו-7.8, דורש מינימום של 63 בקבוקונים של זכרים ו-63 בקבוקונים של נקבות. - אחסנו את הבקבוקונים למשך 48 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 25°C בלחות של כ-60% ועם מחזור אור:כהה של 12:12 שעות. במהלך תקופה זו, הניחו את מגש הבקבוקונים הממוינים בזווית של 60 מעלות כדי למנוע מזבובים להיתקע במזון בזמן שהם מתאוששים מההרדמה.
הערה: שלב זה מאפשר לזבובים להתאושש מהרדמתCO2 . אין להרדים שוב את הזבובים במהלך שארית פרוטוקול החשיפה. - לאחר תקופת ההחלמה של 48 שעות, הוסף 0.75 מ"ל מים מטוהרים סטריליים לבקבוקונים שהוכנו בשלב 1.3. מספר הבקבוקונים שהוכנו בשלב זה צריך להיות זהה למספר הבקבוקונים שהוגדרו בשלב 3.2.
- מעבירים זבובים ממוינים ומותאמים מין לבקבוקון הרעב על ידי פתיחת בקבוקון הזכוכית המכיל את הזבובים משלב 3.2, הכנסתו לפיו של בקבוקון הפלסטיק המוכן, ולאחר מכן הקשה על תחתית בקבוקון הפלסטיק על ספסל. סגור את בקבוקון הפלסטיק עם תקע תאית אצטט (הידוע בכינויו פלוג).
- רשום את כל הזבובים שאבדו בהעברה זו (העבר לרשומות של מספר הזבובים ההתחלתי עבור כל בקבוקון מאוחר יותר).
- סמן בקבוקוני רעב המכילים נקבות זבובים עם פס. השאירו את הבקבוקונים עם זבובים זכרים לא מסומנים כדי למנוע ערבוב מינים בטעות.
- הכינו את תא הלחות לחשיפה למשך הלילה. ראה שלבים 1.4-1.5 לקבלת תיאור כיצד לבנות תא זה.
- הניחו שש מגבות נייר סטנדרטיות בתחתית תא הלחות. משרים את מגבות הנייר ב-100 מ"ל מים.
- הניחו את רשת הפלסטיק (שלב 1.5) מעל המגבות הרטובות כדי להבטיח שהבקבוקונים לא יבואו במגע עם מגבות הנייר הרוויות.
- הניחו את מגשי בקבוקוני הרעב במצב אופקי בתוך תאי הלחות. הניחו את תאי הלחות באינקובטור של 25°C (בלחות של כ-60%) למשך הלילה.
הערה: באופן אידיאלי, תקופת הרעב בלילה נמשכת כ -16 שעות; עם זאת, ניתן להתאים את העיתוי ללוחות זמנים בודדים במעבדה.
4. הכנת פתרונות מלאי
הערה: זבובים מוזנים בכימיקלים ניסיוניים במצע נוזלי של שמרים-סוכרוז. סעיף זה מתאר הכנת תמיסות מלאי של אמצעי הזנה מרוכזים וכימיקלים לבדיקה.
- הכינו תמיסת 4x שמרים-סוכרוז המכילה 16% סוכרוז ו-6% תמצית שמרים (m/v) (ראו טבלת חומרים) מומסת במים מטוהרים סטריליים. Autoclave את התמיסה על מחזור נוזלי עבור זמן העיקור המתאים (למשל, 40 דקות עבור 1 L).
הערה: הפתרון יכול להיעשות בכמויות גדולות ומאוחסן aliquots ב -20 °C. הפשירו אליציטוטים בודדים יום אחד לפני השימוש על ידי הכנסתם למקרר בטמפרטורה של 4°C. - הכינו מלאי של כימיקל הבדיקה. עבור הניסוי הראשוני, פתרון המניות צריך להיעשות בריכוז הגבוה ביותר, כך הכימיקל יכול להיות מומס לחלוטין במים.
הערה: ניתן להשתמש בממסים שאינם מים כדי להמיס את כימיקל הבדיקה. ראה דיון לגבי אזהרות לשימוש בממסים חלופיים. - הכינו תמיסת מלאי צבע כחול 100x על ידי המסת 1 גרם של FD&C כחול מס' 1 (ראו טבלת חומרים) ב-10 מ"ל מים מטוהרים סטריליים.
הערה: ניתן לייצר את תמיסת מלאי הצבע הכחול בכמויות גדולות ולאחסן ב- aliquots ב- 4 °C.
5. הכנת בקבוקוני חשיפה: ניסוי מציאת טווח
הערה: שלבים 5 ו-6 של הפרוטוקול נועדו לזהות את המינון הנמוך ביותר של כימיקל בדיקה שגורם ל-100% קטלניות ואת המינון הגבוה ביותר שלא מצליח לגרום לפנוטיפ קטלני. אם ריכוזים אלה כבר נקבעו על ידי ניסויים קודמים, ראה שלבים 7 ו- 8 לחישוב עקומת מנה-תגובה. יש להכין את אמצעי החשיפה מיד לפני הוספת זבובים לבקבוקוני החשיפה.
- סמן שמונה צינורות צנטריפוגות בנפח 15 מ"ל באופן הבא: (i) ללא כימיקל, (ii) הריכוז הגבוה ביותר, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000.
- הכן את מדיית החשיפה בצינורות הצנטריפוגות המסומנים משלב 5.1 על-ידי הוספה ראשונה של 2.5 מ"ל של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x לכל שמונת הצינורות המסומנים.
- הוסף 7.5 מ"ל של מים מטוהרים סטריליים לצינור שכותרתו "ללא כימיקלים". דילול זה הוא השליטה השלילית.
- הוסף 7.4 מ"ל של תמיסת המלאי הכימי לבדיקה לצינור המסומן כ"ריכוז הגבוה ביותר". הוסף 100 μL של מים מטוהרים סטריליים לצינור זה, כך נפח הסופי הוא 10 מ"ל. חשב ורשום את הטוחנת של כימיקל הבדיקה בתמיסה זו.
הערה: תוספת של 100 μL של מים מטוהרים סטריליים לצינור מבטיחה שהריכוז הכימי בשלב זה יהיה זהה לזה המשמש בשלב 5.5, שבו מוסיפים תמיסת מלאי צבע כחול למדיית החשיפה כשיטה להערכת התנהגות האכלה. - הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים מטוהרים סטריליים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור חייב להיות 10 מ"ל. הריכוז הסופי של כימיקלים לבדיקה בצינורות אלה ביחס לצינור "הריכוז הגבוה ביותר" חייב להיות 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000.
- הכינו ותייגו שמונה בקבוקוני חשיפה עבור כל ריכוז בודד של מדיית חשיפה הנוצרת בשלב 5.1. צריכים להיות שמונה סטים של בקבוקונים (64 בקבוקונים בסך הכל) המכילים את התוויות הבאות: ללא כימיקלים, הריכוז הגבוה ביותר, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000.
- פיפטה 0.75 מ"ל של מדיה חשיפה מוכן בשלב 5.2.3 לתוך הקבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה.
- סמן שמונה צינורות נפרדים של 5 מ"ל באופן הבא: (i) ללא כימיקל, (ii) הריכוז הגבוה ביותר, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000.
- הכינו מדיה לחשיפה לצבע כחול על ידי ערבוב ראשוני של 500 מיקרוליטר של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x ו-20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי צבע כחול בשמונה צינורות מסומנים של 5 מ"ל.
- הוסף 1.48 מ"ל של מים מטוהרים סטריליים לצינור שכותרתו "ללא כימיקל". דילול זה הוא השליטה השלילית.
- הוסף 1.48 מ"ל של תמיסת המלאי הכימי לבדיקה לצינור המסומן כ"ריכוז הגבוה ביותר". לא מוסיפים מים לצינור זה. חשב ורשום את הטוחנת של כימיקל הבדיקה בתמיסה זו.
- הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים מטוהרים סטריליים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור צריך להיות 2 מ"ל. הריכוז הסופי של כימיקל הבדיקה בצינורות אלה ביחס לצינור "הריכוז הגבוה ביותר" צריך להיות 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000.
- הכינו ותייגו שני בקבוקוני חשיפה עם כל ריכוז בנפרד של מדיית חשיפה כחולה. צריכים להיות שמונה סטים של בקבוקונים (16 בקבוקונים בסך הכל) המכילים את התוויות הבאות: ללא כימיקלים, הריכוז הגבוה ביותר, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ו-1:1,000. המילה "כחול" צריכה להיות כתובה גם על בקבוקונים אלה.
- פיפטה 0.75 מ"ל של מדיה חשיפה כחולה לתוך הקבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה כחולים.
6. חשיפה כימית לזבובים: ניסוי מציאת טווח
- הכינו בקבוקוני חשיפה כימית באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים למשך לילה משלב 3.7 באופן הבא:
- מעבירים ארבעה בקבוקונים של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לארבעה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ"נקבה". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- מעבירים ארבעה בקבוקונים של זבובים זכרים מורעבים (20 זבובים לבקבוקון) לארבעה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ"זכר". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- הכינו בקבוקוני חשיפה כימית המכילים צבע כחול באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים מהלילה משלב 3.7 כדלקמן:
- מעבירים בקבוקון אחד של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקון זה כ"נקבה". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- מעבירים בקבוקון אחד של זבובים זכרים מורעבים (20 זבובים לבקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו את הבקבוקון הזה כ"זכר". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- רשום את מספר הזבובים שנמצאים בכל בקבוקון לאחר ההעברה וציין את מספר הזבובים שמתו או ברחו. בדרך כלל, כל 20 הזבובים צריכים לשרוד רעב לילה והעברה.
- הניחו את בקבוקוני החשיפה אופקית בתאי לחות טריים שהוכנו (ראו שלב 3.6 להכנת תא לחות). מקם את התאים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם כ -60% לחות ומחזור אור: כהה של 12:12 שעות.
- יש לבחון את בקבוקוני החשיפה 24 ו-48 שעות לאחר תחילת החשיפה לכימיקלים. ספור ורשום את מספר הזבובים המתים בכל בקבוקון בכל נקודת זמן.
הערה: מוות משמש כקריאה לבדיקה זו, אך ניתן להתאים את הפרוטוקול לבחינת פנוטיפים אחרים. זבובים חשופים נאספים בדרך כלל בנקודות זמן אלה לצורך מחקרים תעתיק ומטבולי. - בדקו את בקבוקוני החשיפה הכחולים 24 שעות לאחר תחילת החשיפה הכימית. השתמש בטכניקות הבאות כדי לקבוע אם זבובים חשופים צרכו את מדיית החשיפה הכחולה:
- בדוק את דפנות הבקבוקון עבור אינדיקציות של צואה כחולה, אשר מופיעים כמו נקודות קטנות בצד של בקבוקון החשיפה, כמו גם על flug.
- מרדימים את הזבובים עם CO2 ובודקים את הבטן לנוכחות צבע כחול.
הערה: בדרך כלל, בקבוקוני חשיפה כחולים מנותחים לאחר 24 שעות. עם זאת, שלב זה יכול להתבצע ב 48 שעות, במקום. לזבובים שאכלו בדרך כלל יש פס כחול דרך הבטן, מה שמעיד על כך שאמצעי החשיפה נכנסו למעיים. - בחנו את הזבובים להתנהגויות אכילה חריגות, כגון רגורגיטציה, התנפחות יבולים והתמוטטות של תפקוד מחסום המעי (מסומן על ידי הופעת צבע כחול ברחבי האורגניזם ולא רק מוגבל למערכת העיכול, המכונה בדרך כלל דרדסים32,33).
- יש להשליך את כל הבקבוקונים, נייר הסינון, הפלוגים והזבובים המזוהמים במיכלי פסולת כימית מתאימים. אם זבובים חיים נשארים בבקבוקונים, הקפיאו את הבקבוקונים כדי להרוג את הזבובים לפני השלכתם למיכל הפסולת המתאים.
הערה: סילוק בקבוקוני חשיפה וזבובים מוכתב על ידי הכימיקלים המנותחים בניסוי. פעל תמיד בהתאם לנוהלי הבטיחות הכימיים המפורטים בדף נתוני הבטיחות הכימית. אם הריכוזים המשמשים בניסוי מציאת הטווח הורגים זבובים במינון הנמוך ביותר, חזרו על סעיף 6 באמצעות סדרת דילול, החל מהריכוז הנמוך ביותר שהרג 100% מהחיות.
7. הכנת בקבוקוני חשיפה: יצירת עקומת מנה-תגובה
הערה: הפרוטוקול המתואר בשלבים 5 ו-6 נועד לקבוע באופן נרחב את הריכוז הכימי הדרוש ליצירת פנוטיפ. שלבים 7 ו-8 של הפרוטוקול משמשים לחישוב עקומת מנה-תגובה מדויקת.
- חשב את הריכוזים הכימיים שיש לנתח כדי ליצור עקומת מנה-תגובה בשיטה הבאה:
- קבע את הריכוז הנמוך ביותר של כימיקל הבדיקה שהורג 100% מהזבובים החשופים לאחר 48 שעות.
- לקבוע את הריכוז הגבוה ביותר של כימיקל הבדיקה שאין לו השפעה על הכדאיות ב 48 שעות.
- חישוב ארבעה ריכוזים נוספים המתחלקים שווה בשווה בין הריכוזים שנקבעו בשלבים 7.1.1 ו-7.1.2.
- סמן תשעה צינורות צנטריפוגות בודדות של 15 מ"ל עם הטוחנת של הריכוזים הבאים: (i) ללא כימיקל, (ii) ריכוז שנקבע בשלב 7.1.1, (iii) ריכוז שנקבע בשלב 7.1.2, (iv) ריכוזים שנקבעו ב-7.1.3, (v) כפול מהריכוז שנקבע בשלב 7.1.1, (vi) דילול ריכוז של 1:2 שנקבע בשלב 7.1.2.
הערה: הכללת ריכוזים כפולים מהריכוז שנקבע ב-7.1.1 ודילול של 1:2 מזה שנקבע בשלב 7.1.2 חשובה לחישוב מדויק של עקומת המינון-תגובה. - הכן את מדיית החשיפה על ידי הוספה ראשונה של 2.5 מ"ל של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x לתשעה צינורות צנטריפוגות בודדות מסומנות של 15 מ"ל שהוכנו בשלב 7.2.
- הוסף 7.5 מ"ל של מים מטוהרים סטריליים לצינור שכותרתו "ללא כימיקלים". דילול זה הוא השליטה השלילית.
- הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים מטוהרים סטריליים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור חייב להיות 10 מ"ל. הריכוז הסופי של כימיקל בתוך צינור בודד צריך להיות שווה לזה שנכתב בצד החיצוני של הצינור.
- הכינו ותייגו 12 בקבוקוני חשיפה עבור כל ריכוז של מדיית חשיפה הנוצרת בשלב 7.2. צריך להיות תשעה סטים של בקבוקונים (108 בקבוקונים בסך הכל).
- פיפטה 0.75 מ"ל של מדיה חשיפה לתוך קבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה.
הערה: שלבים 7.6 עד 7.8 הם אופציונליים. אם ידוע שהריכוזים הכימיים שהוכנו בשלב 7.2 אינם משפיעים על התנהגות ההאכלה, ניתן לדלג על שלבים אלה. - הכינו ותייגו תשעה צינורות שונים של 5 מ"ל עבור מדיה בחשיפה כחולה עם אותה סדרת ריכוזים המשמשת בשלב 7.2.
- הכינו מדיה לחשיפה לצבע כחול על ידי ערבוב ראשוני של 500 μL של תמיסת מלאי שמרים/סוכרוז 4x ו-20 μL של תמיסת ציר צבע כחול.
- הוסף 1.48 מ"ל של מים סטריליים מטוהרים לצינור שכותרתו "ללא כימיקלים". דילול זה הוא השליטה השלילית.
- הוסף את הכמות המתאימה של תמיסת מלאי כימי בדיקה ומים סטריליים מטוהרים לצינורות הנותרים. הנפח הסופי של כל צינור חייב להיות 2 מ"ל. הריכוז הסופי של כימיקל בתוך צינור בודד צריך להיות שווה לזה שנכתב בצד החיצוני של הצינור.
- הכינו ותייגו שני בקבוקוני חשיפה לכל ריכוז בודד של מדיית חשיפה כחולה. צריכות להיות תשע קבוצות של בקבוקונים (18 בקבוקונים בסך הכל), כאשר כל קבוצה של בקבוקונים מסומנת בריכוזים המפורטים בשלב 7.2. המילה "כחול" צריכה להיות כתובה גם על בקבוקונים אלה.
- פיפטה 0.75 מ"ל של מדיה חשיפה כחולה לתוך הקבוצה המתאימה של בקבוקוני חשיפה כחולים.
8. חשיפה לכימיקלים של זבובים: יצירת עקומת מנה-תגובה
- הכינו בקבוקוני חשיפה כימית באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים למשך לילה משלב 3.7 באופן הבא:
- מעבירים שישה בקבוקונים של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לשישה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ"נקבה". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- מעבירים שישה בקבוקונים של זבובים זכרים מורעבים (20 זבובים לבקבוקון) לשישה בקבוקוני חשיפה מכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקונים אלה כ"זכר". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- הכינו בקבוקוני חשיפה כימית המכילים צבע כחול באמצעות בקבוקונים של זבובים מורעבים מהלילה משלב 3.7 כדלקמן:
- מעבירים בקבוקון אחד של נקבות זבובים מורעבות (20 זבובים לבקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו בקבוקון זה כ"נקבה". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- מעבירים בקבוקון אחד של זבובים זכרים מורעבים (עשרים זבובים בכל בקבוקון) לבקבוקון חשיפה כחול אחד לכל ריכוז כימי. תייגו את הבקבוקון הזה כ"זכר". השתמש באותה שיטת העברה המתוארת בשלב 3.5.
- רשום את מספר הזבובים הנמצאים בכל בקבוקון לאחר ההעברה. בדרך כלל, כל 20 הזבובים צריכים לשרוד את הרעב וההעברה בלילה, אך יש לוודא שכל מה שמת או נמלט במהלך ההעברה יופחת מהסך הכולל.
- הניחו את בקבוקוני החשיפה אופקית בתאי לחות טריים שהוכנו (ראו שלב 3.6 להכנת תא לחות). מקם את התאים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם כ -60% לחות ומחזור אור: כהה של 12:12 שעות.
- יש לבחון את בקבוקוני החשיפה 24 ו-48 שעות לאחר תחילת החשיפה לכימיקלים. ספור ורשום את מספר הזבובים המתים בכל בקבוקון בכל נקודת זמן.
- בדקו את בקבוקוני החשיפה הכחולים 24 שעות לאחר תחילת החשיפה הכימית. השתמש בשיטה המתוארת בשלב 6.6 כדי להעריך שינויים בהתנהגות ההאכלה.
- יש להשליך את כל הבקבוקונים, נייר הסינון, הפלוגים והזבובים המזוהמים במיכלי פסולת כימית מתאימים. אם נשארים זבובים חיים בבקבוקונים, הקפיאו את הבקבוקונים כדי להרוג את הזבובים לפני השלכתם למיכל הפסולת המתאים.
הערה: סילוק בקבוקוני חשיפה וזבובים מוכתב על ידי הכימיקלים המנותחים בניסוי. פעל תמיד בהתאם לנוהלי הבטיחות הכימיים המפורטים בדף נתוני הבטיחות הכימית.
9. חישוב עקומת מנה-תגובה
- השתמש בתוכנת Benchmark Dose (BMDS, גרסה 3.2; ראה טבלת חומרים) או בתוכנה דומה אחרת כדי לנתח את הנתונים34. להלן תיאור זרימת העבודה באמצעות תוכנת BMDS.
- לחץ על הכרטיסייה נתונים של BMDS ולחץ על הכנס ערכת נתונים חדשה. הזן את מספר הדגימות בערכת הנתונים, לחץ על דיכוטומי ולאחר מכן לחץ על צור ערכת נתונים. הזן כל שכפול כשורה נפרדת בערכת הנתונים.
- הזן את המינון בעמודה הראשונה של הטבלה שנוצרה, את המספר ההתחלתי של זבובים למעט זבובים שמתו או אבדו לפני שלב 8.3) בעמודה השנייה, ואת מספר הזבובים שמתו מחשיפה כימית בעמודה השלישית.
- לחץ על הכרטיסייה הראשית של BMDS.
- לחץ על החץ הנפתח עבור התפריט בחר סוג דגם ולחץ על דיכוטומי.
- לחץ על הפוך לזמין עבור ערכת הנתונים משלב 9.2 בטבלה ערכות נתונים.
- לחץ על התיבות עבור המודלים הרצויים לניתוח בטבלת MLE וחלופות.
הערה: מודל הגבעה הדיכוטומית המוגבלת התכופה שימש בעיקר. - לחץ על ניתוח הפעלה. התוכנה תפיק קובץ פלט עם עקומות הקטלניות ופרטים נוספים על המודלים.
Representative Results
הזבוב משמש מזה זמן רב כמודל במחקרים לקביעת רעילות נתרן ארסן (NaAsO2)35,36,37,38. כדי להדגים את יעילות הפרוטוקול, זבובים זכרים ונקבות נחשפו ל-NaAsO2, במטרה להשוות תוצאות אלה למחקרים קודמים. באמצעות המתודולוגיה שתוארה לעיל, זכרים ונקבות בוגרים של Oregon-R (BDSC stock #2057) נחשפו לטווח של ריכוזי NaAsO 2 (0, 0.01, 0.02, 0.1, 0.2, 1ו-2 מילימול) וקיבלו ציון קטלניות 48 שעות לאחר תחילת החשיפה (איור 1A,B).
מטרת ניתוח ראשוני זה הייתה לזהות את טווח הריכוזים המשוער שיאפשר אפיון מדויק יותר של רעילות NaAsO2. בניסויים הבאים נבחרו ריכוזים (0, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 ו-5 מילימול) שהגדירו בצורה מדויקת יותר את עקומת מנה-תגובהNaAsO 2 (איור 1C,D). יש לציין כי הניתוח שהתקבל בדק מספר ריכוזים שגרמו ל-100% קטלניות. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת מינון המדידה של הסוכנות להגנת הסביבה הזמינה לציבור גרסה 3.2.0.125. הנתונים עוצבו כ"דיכוטומיים" ומודל הגבעה הדיכוטומית שימש לניתוחים הבאים. בהתבסס על מודל זה, LD10, LD25 ו-LD 50 הסופיים של הזבובים הזכרים שניזונו מ-NaAsO2 היו 0.30 מילימול,0.50 מילימטר ו-0.65 מילימול, בהתאמה. עבור נקבות זבובים, ערכים אלה היו מעט גבוהים יותר, עם LD10 של 0.30 מילימול, LD25 של 0.65 מילימול, ו- LD50 של 0.90 מילימול. בסך הכל, הערכים המתקבלים בשיטה זו דומים לאלה שדווחו בעבר עבור רעילות ארסן ב- Drosophila melanogaster35,36,37,38, ובכך מאמתים את המתודולוגיה.
בנוסף לששת הרפליקטים המשמשים לחישוב עקומת המינון-תגובה, זבובים זכרים ונקבות קיבלו גם תמיסות חשיפה NaAsO2 שהכילו 1% FD&C כחול, אשר ניתן לראות בקלות במערכת העיכול באמצעות מיקרוסקופ אור. בהתבסס על נוכחות של צבע כחול בתוך המעי של זבובים שניזונומ-NaAsO 2, גם הזבובים הזכרים וגם הזבובים הנקביים המשיכו לאכול 24 שעות לאחר תחילת החשיפה הכימית, ללא קשר לריכוז NaAsO 2 שנמצא בתוך המצע הנוזלי (איור 2). אולם המזון שנבלע נצפה מדי פעם במינונים של מעל 0.2 מילימול אצל נקבות ו-0.5 מילימול אצל זכרים (איור 2). ממצאים אלה מצביעים על כך שרגורגיטציה עשויה לשמש תפקיד מפתח בתגובת דרוזופילה להרעלת ארסן.
איור 1: עקומות מנה-תגובה עבור דרוזופילה זכרית ונקבית שטופלו ב-NaAsO2 במשך 48 שעות. כל הגרפים מראים את הפרופורציות המשוערות של זבובים מתים בכל ריכוז NaAsO2 שנבדק בהתבסס על מודל הגבעה הדיכוטומית. (א,ב) טווח רחב של ריכוזי NaAsO2 נבדק כדי להעריך בקירוב את המינון שבו כל מין של זבוב מתחיל למות. (A) מציג את נתוני הזכר, ו-(B) מציג את הנתונים הנשיים. N = 4 בקבוקונים, עם 20 זבובים לכל בקבוקון. (ג,ד) טווח צר יותר של ריכוזי NaAsO2 נבדק כדי לקבוע מינונים מדויקים שבהם מתו 10%, 25% ו-50% מכל מין של זבובים. מינונים אלה מסומנים מימין לכל גרף. (C) מציג את הנתונים הגבריים, ו-(D) מציג את הנתונים הנשיים. N = 6 בקבוקונים, עם 20 זבובים לכל בקבוקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות מייצגות מבדיקת הצבע הכחול של דרוזופילה זכרית ונקבית שטופלו ב-NaAsO2 במשך 24 שעות. מיקרוגרפים מראים שזבובים ניזונים מריכוזים הולכים וגדלים של NaAsO2. שורה (A) מראה זבובים זכרים, ושורה (B) מראה זבובים נקבות, כאשר ריכוז NaAsO2 עולה משמאל לימין. הבטן מראה כמות קטנה של כחול ליד בית החזה בריכוזים נמוכים, מה שמעיד על כך שאמצעי החשיפה נכנסו למעיים. בריכוזים גבוהים יותר, צבע כחול מתחיל להצטבר סביב הפה, מה שמרמז על חשיפה חוזרת. סרגל קנה המידה הוא 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
זבוב הפירות Drosophila melanogaster מתגלה כמערכת רבת עוצמה עבור NAMs16,18,19,21. על ידי מינוף המשאבים הגנטיים חסרי התקדים הזמינים לקהילת הזבובים, בשילוב עם ההתקדמות האחרונה בגנומיקה ובמטבולומיקה, מחקרי בטיחות כימיים המשתמשים בדרוזופילה מסוגלים לזהות במהירות את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם תרכובות בודדות מפריעות לחילוף חומרים, פיזיולוגיה ואיתות תאי (לדוגמה, ראו39). פרוטוקול זול זה נועד להגדיר במהירות עקומות מנה-תגובה ולאחר מכן לייצר דגימות עבור RNA-seq וניתוח מטבולומי. יתר על כן, פרוטוקול גמיש זה יכול להיות מותאם לשימוש עם כל גנוטיפ והוא יכול להכיל סוגים רבים של כימיקלים.
היבט בולט של פרוטוקול זה הוא בחירת המזון הנוזלי המשמש בחשיפה הכימית, המבוססת על מחקר קודם, אך שונה מהמדיה המוצקה המשמשת את רוב המחקרים הטוקסיקולוגיים של דרוזופילה 18,22. המצע הנוזלי הספציפי הזה נבחר כדי לשקף את התוכן התזונתי של מצע ה-BDSC הסטנדרטי והמוצק שהזבובים ניזונים ממנו גם בפרוטוקול זה, כדי להבטיח שהזבובים יקבלו תזונה עקבית. לפשטות של מדיה האכלה נוזלית יש יתרונות רבים. קל יותר לטפל במדיה נוזלית מאשר במזון מוצק, שיש להמיס ולמצק מחדש או להרכיב מחדש מאבקה. מדיה נוזלית גם מגדילה את תפוקת המערכת, מבטיחה פיזור כימי אחיד בכל אמצעי ההזנה, ומפחיתה את זמן העבודה עם חומרים מסוכנים. בנוסף, התקשורת אינה דורשת חימום פתרונות, מה שמאפשר בדיקה של תרכובות בדיקה נדיפות. לבסוף, בגלל המרכיבים המעטים יחסית הכלולים בתמיסת המזון, תגובות לוואי לא רצויות ממוזערות בין כימיקל הבדיקה לבין רכיבים תזונתיים אחרים. השמרים המשמשים במזון גם אינם פעילים, מה שמגביל עוד יותר את תגובתיות אמצעי ההאכלה. עם זאת, יש לציין כי השיטה אינה מתאימה לבדיקת רעילות התפתחותית או רעילות זחלים.
חלק מהחומרים המשמשים בפרוטוקול ניתנים להחלפה, כגון שימוש בבקבוקוני זבוב זכוכית במקום פוליפרופילן. עם זאת, החומרים בהם נעשה שימוש נבחרו להיות אינרטיים וחד פעמיים כדי למנוע תגובות כימיות לא רצויות בין ריאגנטים וחשיפות כימיות שעלולות לנבוע מניקוי כלי זכוכית.
השימוש במזון נוזלי מחייב כלי למשלוח מזון. נייר מסנן תאית אצטט נבחר למטרה זו בשל גמישותו ואופיו האינרטי28. חוקרים אחרים השתמשו בפרוטוקולים דומים אך עם כלי רכב אחרים, כגון מגבוני משימה עדינים או מסנן סיבי זכוכית29,30. נייר פילטר תאית אצטט התאים לצרכים אלה מכיוון שמדובר ברכב אינרטי שניתן לחתוך לצורה האידיאלית כדי להתאים אותו לתחתית בקבוקוני הזבוב ללא רווחים גדולים בין הנייר לדופן הבקבוקון, מה שמונע מוות כתוצאה מזבובים שנתקעו במדיה או ברכב עצמו.
מגבלה חשובה של מערכת זו היא שהריכוז המרבי הניתן לבדיקה של כימיקל קשור למסיסות הכימיקל. תרכובות שאינן מסיסות במים דורשות ממס נוסף, אשר יכול להוביל להשפעות נוספות או סינרגטיות עם הכימיקל המעניין. זה יכול גם ליצור מצבים שבהם לא ניתן להכין פתרונות מלאי מרוכזים מספיק כדי להשיג את נקודת הקצה הרצויה בכל האורגניזמים, ולכן מגביל את הניתוח של הנתונים המתקבלים31. כדי להתמודד עם זה, כימיקלים עם מסיסות מים נמוכה ניתן לבדוק על ידי הוספת עד 0.5% dimethyl sulfoxide לתמיסת מזון. ניתן להשתמש גם בממסים אחרים, אך יש צורך במחקר נוסף עבור כל ממס מעניין כדי לקבוע את ריכוז הממס המרבי המקובל בתמיסה כדי למקסם את המסיסות תוך מזעור השפעות הממס על האורגניזם.
אפיון נרחב של תגובת חוש הריח בדרוזופילה תיאר כיצד זבובים נמנעים מצריכת תרכובות רעילות40,41, מה שמוביל להזנה מופחתת במדיה מטופלת. בדיקת הצבע הכחול מטפלת בתופעה זו בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לסנן ביעילות את התנהגויות האכילה של הזבובים הניזונים מכל ריכוז של כימיקל ניסיוני42,43,44. נוכחותו או היעדרו של כחול במערכת העיכול של הזבוב מציין אם הזבוב אכל את המדיום המכיל רעילים. למרות שקיימות שיטות מתוחכמות יותר להערכת התנהגויות האכלת זבובים, כגון מונה אינטראקציה בין זבוב למזון נוזלי45, שיטה איכותית זו מתאימה יותר לסינון בתפוקה גבוהה יותר.
היבט בולט של פרוטוקול זה הוא שהוא עבר אופטימיזציה לתקופת חשיפה של 48 שעות ללא צורך להעביר זבובים או להוסיף נוזל נוסף לבקבוקון החשיפה. שימוש בתא לחות והצבת התאים באינקובטור שנשמר בלחות גבוהה מנעו מנייר הסינון המכיל את אמצעי ההזנה להתייבש במהלך פרק זמן זה. ניתן להתאים את הפרוטוקול לפרקי חשיפה ארוכים יותר, אך יש להתאים את השיטה כדי להבטיח שנייר הסינון לא יתייבש ויגרום לשינויים משמעותיים בריכוז התמיסה או בקטלניות עקב התייבשות.
לבסוף, מאפיין חשוב של פרוטוקול זה הוא שהוא יכול להתאים בקלות לווריאנטים גנטיים, מה שמאפשר לחוקרים להשתמש במגוון העצום של כלים גנטיים עבור דרוזופילה כדי להרחיב את המחקרים הראשוניים האלה על אורגניזמים מסוג בר כדי להבין טוב יותר מנגנונים של פעולה כימית in vivo. בהקשר זה, ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקול המתואר לעיל כדי להשלים פרוטוקול JoVE שתואר קודם לכן על ידי פיטרסון ולונג המאפשר ניתוח טוקסיקולוגי של זבובים שנלכדו בטבע18.
בגלל המגוון הרחב של מחקרים קודמים על רעילות נתרן ארסן בדרוזופילה 32,33,34,35,36, זבובי אורגון-R טופלו בתרכובת זו כדי להדגים את יעילות המערכת שלנו. זבובים זכרים הציגו LD 50 של 0.65 מילימול, ונקבות הציגו LD50 של 0.90 מילימול. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים של דרוזופילה למבוגרים שטופלו בנתרן ארסניט. לדוגמה, גולדשטיין ובביץ'37 מצאו כי 50% מהזבובים (מינים מעורבים) מתו לאחר 7 ימים של חשיפה ל-0.5 מילימטר NaAsO2. למרות שמדובר במינון מעט נמוך יותר ממה שנצפה כיום, ההבדלים בין השיטות שלהם לבין שיטה זו (כולל שימוש באמצעי חשיפה מוצקים, טווח זמן ארוך יותר ומינים מעורבים) ככל הנראה מסבירים הבדל זה. חשוב לציין, שתי השיטות הביאו לערכי LD50 דומים בסך הכל.
תצפיות מניסויים המשתמשים בפרוטוקול זה יכולות לשמש למציאת מטרות גנטיות ומולקולריות למחקרים התנהגותיים או מכניסטיים הבאים. שיטת החשיפה יכולה לשמש גם לטיפול בדרוזופילה לצורך דגימה עבור מטבולומיקה ופרוטאומיקה, מה שהופך פרוטוקול זה מתאים היטב לתחום הצומח של טוקסיקולוגיה מדויקת (מודל מתחום הרפואה המדויקת46). בהקשר זה, ניתן לאסוף זבובים חשופים לאחר שלב 8 לניתוח גנומי ומטאבולומי עוקב. לאחר מכן ניתן לעבד דגימות שנאספו בשלב 8, כפי שמתואר על ידי לי וטנסן47, החל משלב 3.
בסופו של דבר, הנתונים המתקבלים מהניסויים שתוארו לעיל, כמו גם כל נתוני המטבולומיקה והפרוטאומיקה שלאחר מכן, ישמשו באופן אידיאלי להשוואות בין מינים. כפי שצוין קודם לכן26, מחקרים חוצי מינים כאלה הם רבי עוצמה ומסוגלים לקבוע כיצד כימיקלים בודדים מפריעים למסלולים ביולוגיים שמורים. לפיכך, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר לעיל כדי למצוא מכנה משותף אבולוציוני בתגובה לרעלים בודדים ברחבי פילה ולסייע בוויסות הבטיחות הכימית.
Disclosures
אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לצוות שלנו על העזרה בבדיקה ובאופטימיזציה של פרוטוקול זה: אמיה בלמקאר, מרילין קלארק, אלכסנדר פיט, אמה רוז גלנט, איתן גולדיץ', מתיו לאו, מורגן מארש, קייל מקלונג, אנדי פוגה, דארסי רוז, קמרון סטוקברידג' ונואל זולמן. אנו מודים גם לעמיתינו מקבוצת הטוקסיקולוגיה המדויקת, ובמיוחד לעמיתינו בקבוצת החשיפה, על עזרתם לזהות את מטרות הפרוטוקול.
פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס' 965406. העבודה המוצגת בפרסום זה בוצעה במסגרת אשכול ASPIS. פלט זה משקף רק את עמדות המחברים, והאיחוד האירופי אינו יכול להיות אחראי לכל שימוש שעשוי להיעשות במידע הכלול בו. פרסום זה התאפשר גם בתמיכת המכון למדעים קליניים ותרגומיים של אינדיאנה, הממומן בחלקו על ידי פרס מספר UL1TR002529 מהמכונים הלאומיים לבריאות, פרס המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, המדעים הקליניים והתרגומיים. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. חלקים מפרויקט זה נתמכו על ידי קרנות מאוניברסיטת אינדיאנה שהוענקו ל-JRS ולקונסורציום PhyloTox. JMH ו-EMP נתמכו על ידי P40OD018537 פרס NIH למרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
| 2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
| 5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
| Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
| Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
| CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
| Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
| Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
| Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
| Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
| FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
| Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
| Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
| Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
| Mesh for humidity chamber | |||
| Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
| Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
| Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
| Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
| Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
| Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
| Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
| Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
| Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |
References
- United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
- Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022).
- Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.epa.gov/cci (2022).
- Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022).
- United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
- Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022).
- United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
- Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021).
- Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
- Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
- Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
- European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland, 19-20 April 2016 (2016).
- Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
- Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
- Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
- Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
- Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
- Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
- Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
- Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
- Markstein, M. Drosophila Workers Unite! A Laboratory Manual for Working with Drosophila. , Available from: http://marksteinlab.org/wp-content/uploads/2019/01/MicheleMarkstein-DrosophiliaWorkersUnite-PREPRINT-JAN2019.pdf (2018).
- Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
- Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022).
- Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? - ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022).
- Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
- Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
- Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
- Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
- Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
- Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
- Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
- Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
- Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
- National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , National Academies Press. US. (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).
