Сборка липосом с октанолом на чипе для биоинженерии
Summary
Настоящий протокол описывает октанол-ассистированную сборку липосом (OLA), микрофлюидный метод получения биосовместимых липосом. OLA производит монодисперсные липосомы микронного размера с эффективной инкапсуляцией, что позволяет немедленно проводить эксперименты на кристалле. Ожидается, что этот протокол будет особенно подходящим для синтетической биологии и исследований синтетических клеток.
Abstract
Микрофлюидика является широко используемым инструментом для получения капель и везикул различных видов контролируемым и высокопроизводительным способом. Липосомы представляют собой упрощенные клеточные имитаторы, состоящие из водной внутренней части, окруженной липидным бислоем; Они ценны для проектирования синтетических клеток и понимания основ биологических клеток in vitro и важны для прикладных наук, таких как доставка грузов для терапевтических применений. В этой статье подробно описывается рабочий протокол для микрофлюидного метода на кристалле, сборки липосом с помощью октанола (OLA), для получения монодисперсных биосовместимых липосом микронного размера. OLA функционирует аналогично выдуванию пузырьков, когда внутренняя водная (IA) фаза и окружающая липидосодержащая 1-октанольная фаза отщепляются внешними потоками жидкости, содержащими поверхностно-активное вещество. При этом легко образуются капли двойной эмульсии с выступающими октанольными карманами. Когда липидный бислой собирается на границе раздела капель, карман самопроизвольно отделяется, образуя однослойную липосому, готовую к дальнейшим манипуляциям и экспериментам. OLA обеспечивает ряд преимуществ, таких как стабильная генерация липосом (>10 Гц), эффективная инкапсуляция биоматериалов и монодисперсные популяции липосом и требует очень малых объемов образца (~ 50 мкл), что может иметь решающее значение при работе с драгоценными биологическими препаратами. Исследование включает в себя подробную информацию о микрообработке, мягкой литографии и пассивации поверхности, которые необходимы для внедрения технологии OLA в лаборатории. Доказательство принципа применения синтетической биологии также показано путем индуцирования образования биомолекулярных конденсатов внутри липосом посредством трансмембранного потока протонов. Ожидается, что этот сопроводительный видеопротокол облегчит читателям установку и устранение неполадок OLA в своих лабораториях.
Introduction
Все клетки имеют плазматическую мембрану в качестве своей физической границы, и эта мембрана по существу представляет собой каркас в виде липидного бислоя, образованного самосборкой амфифильных липидных молекул. Липосомы являются минимальными синтетическими аналогами биологических клеток; Они имеют водный просвет, окруженный фосфолипидами, которые образуют липидный бислой с гидрофильными головными группами, обращенными к водной фазе, и гидрофобными хвостами, заглубленными внутрь. Стабильность липосом определяется гидрофобным эффектом, а также гидрофильностью между полярными группами, силами Ван-дер-Ваальса между гидрофобными углеродными хвостами и водородной связью между молекулами воды и гидрофильными головками 1,2. В зависимости от количества липидных бислоев липосомы можно разделить на две основные категории, а именно: однослойные везикулы, содержащие один бислой, и многослойные везикулы, построенные из нескольких бислоев. Однопластинчатые везикулы дополнительно классифицируются в зависимости от их размеров. Обычно сферической формы, они могут быть изготовлены в различных размерах, включая небольшие однослойные везикулы (SUV, диаметр 30-100 нм), большие однослойные везикулы (LUV, диаметр 100-1000 нм) и, наконец, гигантские однослойные везикулы (GUV, диаметр >1,000 нм)3,4. Для получения липосом были разработаны различные методы, и их можно разделить на объемные методы5 и микрофлюидные методы6. Обычно практикуемые объемные методы включают регидратацию липидной пленки, электроформацию, перенос инвертированной эмульсии и экструзию 7,8,9,10. Эти методы относительно просты и эффективны, и это основные причины их широкого использования в сообществе синтетической биологии. Однако в то же время они страдают серьезными недостатками, связанными с полидисперсностью по размеру, отсутствием контроля над ламеллярностью и низкой эффективностью инкапсуляции 7,11. Такие методы, как инкапсуляция непрерывного пересечения интерфейса капель (cDICE)12 и капельная съемка и фильтрация по размеру (DSSF)13, в некоторой степени преодолевают эти ограничения.
За последнее десятилетие микрофлюидные подходы приобрели все большее значение. Микрофлюидная технология обеспечивает управляемую среду для управления потоками жидкости в заданных пользователем микроканалах благодаря характерному ламинарному течению и массообмену с преобладанием диффузии. Полученные в результате устройства «лаборатория-на-чипе» предлагают уникальные возможности для пространственно-временного контроля молекул со значительно уменьшенными объемами образцов и возможностями мультиплексирования14. Были разработаны многочисленные микрофлюидные методы получения липосом, в том числе импульсная струя15, двойная эмульсионная шаблонизация16, переходный мембранный выброс 17, перенос капельной эмульсии 18 и гидродинамическая фокусировка 19. Эти методы позволяют получить монодисперсные, одноламеллярные липосомы размером с клетку с высокой эффективностью инкапсуляции и высокой пропускной способностью.
В этой статье подробно описана процедура сборки липосом с помощью октанола (OLA), микрофлюидного метода на кристалле, основанного на гидродинамическом отщипывании и последующем механизме обезвоживания растворителем20 (рис. 1). Работу OLA можно связать с процессом выдувания пузырей. Шестистороннее соединение фокусирует внутреннюю водную (IA) фазу, два липидонесущих органических (LO) потока и два внешних водных потока (OA), содержащих поверхностно-активное вещество, в одном месте. Это приводит к образованию двойных капель эмульсии вода-в-(липиды + октанол) в воде. По мере того, как эти капли текут вниз по потоку, минимизация межфазной энергии, внешний сдвиговый поток и взаимодействие со стенками канала приводят к образованию липидного бислоя на границе раздела по мере того, как карман растворителя отделяется, образуя тем самым однослойные липосомы. В зависимости от размера октанольного кармана процесс обезвоживания может занять от десятков секунд до нескольких минут. В конце выходного канала менее плотные капли октанола всплывают на поверхность, тогда как более тяжелые липосомы (из-за более плотного инкапсулированного раствора) опускаются на дно камеры визуализации, готовые к экспериментам. В качестве репрезентативного эксперимента продемонстрирован процесс разделения жидкостной и жидкостной фаз (LLPS) внутри липосом. Для этого необходимые компоненты инкапсулируются внутри липосом при кислом рН, что предотвращает LLPS. При внешнем вызове изменения рН и, таким образом, трансмембранного потока протонов, внутри липосом образуются разделенные по фазам капли конденсата. Это подчеркивает эффективные возможности инкапсуляции и манипулирования системой OLA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клеточная сложность делает чрезвычайно трудным понимание живых клеток при изучении в целом. Снижение избыточности и взаимосвязанности клеток путем воссоздания ключевых компонентов in vitro необходимо для дальнейшего понимания биологических систем и создания искусственных клеточных и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Дольфа Вейерса, Веру Горелову и Марка Розена за любезно предоставленную нам YFP. S.D. благодарит за финансовую поддержку со стороны Голландского исследовательского совета (номер гранта: OCENW. KLEIN.465).
Materials
| 1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
| 1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
| ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
| Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
| Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
| Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
| DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
| F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
| Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
| Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
| Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
| Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
| Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
| Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
| Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
| Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
| Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
| Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
| Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
| Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
| UV laser | 365 nm wavelength |
References
- Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
- Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
- Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
- Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
- Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
- van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
- Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
- Zhang, H., D’Souza, G. G. M. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. , 17-22 (2017).
- Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
- Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
- Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
- Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
- Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
- Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
- Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
- Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
- Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
- Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
- Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
- Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
- Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
- Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
- Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
- Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
- Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
- Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
- Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
- Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
- Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
- Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
- Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
- Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
- Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
- Banlaki, I., Lehr, F. -. X., Niederholtmeyer, H., Karim, A. S., Jewett, M. C. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. , 237-255 (2022).
