On-chip octanolassisteret liposomsamling til bioteknologi
Summary
Denne protokol beskriver octanol-assisteret liposomsamling (OLA), en mikrofluidisk teknik til generering af biokompatible liposomer. OLA producerer monodispergerede, mikron-størrelse liposomer med effektiv indkapsling, hvilket muliggør øjeblikkelig on-chip eksperimentering. Denne protokol forventes at være særlig velegnet til syntetisk biologi og syntetisk celleforskning.
Abstract
Microfluidics er et meget anvendt værktøj til at generere dråber og vesikler af forskellig art på en kontrolleret og høj gennemstrømningsmåde. Liposomer er forenklede cellulære efterligninger sammensat af et vandigt interiør omgivet af et lipiddobbeltlag; De er værdifulde til at designe syntetiske celler og forstå fundamentet for biologiske celler på en in vitro måde og er vigtige for anvendte videnskaber, såsom fragtlevering til terapeutiske anvendelser. Denne artikel beskriver en detaljeret arbejdsprotokol for en on-chip mikrofluidisk teknik, octanolassisteret liposomsamling (OLA), til fremstilling af monodispergerede, mikronstørrelse, biokompatible liposomer. OLA fungerer på samme måde som bobleblæsning, hvor en indre vandig (IA) fase og en omgivende lipidbærende 1-octanolfase klemmes af overfladeaktive ydre væskestrømme. Dette genererer let dobbeltemulsionsdråber med fremspringende oktanollommer. Når lipiddobbeltlaget samles ved dråbegrænsefladen, løsnes lommen spontant for at give anledning til et unilamellært liposom, der er klar til yderligere manipulation og eksperimentering. OLA giver flere fordele, såsom stabil liposomgenerering (>10 Hz), effektiv indkapsling af biomaterialer og monodispergerede liposompopulationer og kræver meget små prøvevolumener (~ 50 μL), hvilket kan være afgørende, når man arbejder med dyrebare biologiske. Undersøgelsen indeholder detaljer om mikrofabrikation, blød litografi og overfladepassivering, som er nødvendige for at etablere OLA-teknologi i laboratoriet. En proof-of-principle syntetisk biologi ansøgning er også vist ved at inducere dannelsen af biomolekylære kondensater inde i liposomerne via transmembran protonflux. Det forventes, at denne ledsagende videoprotokol vil gøre det lettere for læserne at etablere og fejlfinde OLA i deres laboratorier.
Introduction
Alle celler har en plasmamembran som deres fysiske grænse, og denne membran er i det væsentlige et stillads i form af et lipiddobbeltlag dannet ved selvmontering af amfifile lipidmolekyler. Liposomer er de minimale syntetiske modstykker af biologiske celler; De har et vandigt lumen omgivet af fosfolipider, som danner et lipiddobbeltlag med de hydrofile hovedgrupper, der vender mod den vandige fase og de hydrofobe haler begravet indad. Stabiliteten af liposomer styres af den hydrofobe effekt såvel som hydrofiliciteten mellem de polære grupper, van der Waals-kræfter mellem de hydrofobe kulstofhaler og hydrogenbindingen mellem vandmolekyler og de hydrofile hoveder 1,2. Afhængigt af antallet af lipiddobbeltlag kan liposomer klassificeres i to hovedkategorier, nemlig unilamellære vesikler bestående af et enkelt dobbeltlag og multilamellære vesikler konstrueret af flere dobbeltlag. Unilamellære vesikler klassificeres yderligere baseret på deres størrelser. Typisk sfæriske i form kan de produceres i forskellige størrelser, herunder små unilamellære vesikler (SUV, 30-100 nm diameter), store unilamellære vesikler (LUV, 100-1,000 nm diameter) og endelig kæmpe unilamellære vesikler (GUV, >1,000 nm diameter)3,4. Forskellige teknikker er blevet udviklet til fremstilling af liposomer, og disse kan kategoriseres bredt i bulkteknikker5 og mikrofluidiske teknikker6. Almindeligt praktiserede bulkteknikker omfatter lipidfilmrehydrering, elektrodannelse, inverteret emulsionsoverførsel og ekstrudering 7,8,9,10. Disse teknikker er relativt enkle og effektive, og disse er hovedårsagerne til deres udbredte anvendelse i syntetisk biologi samfund. Samtidig lider de imidlertid af store ulemper med hensyn til polydispersiteten i størrelse, manglen på kontrol over lamelenheden og lav indkapslingseffektivitet 7,11. Teknikker som kontinuerlig dråbegrænsefladekrydsning (cDICE)12 og dråbeoptagelse og størrelsesfiltrering (DSSF)13 overvinder til en vis grad disse begrænsninger.
Mikrofluidiske tilgange er steget til fremtrædende plads i løbet af det sidste årti. Mikrofluidisk teknologi giver et kontrollerbart miljø til manipulation af væskestrømme inden for brugerdefinerede mikrokanaler på grund af den karakteristiske laminære strømning og diffusionsdominerede masseoverførsel. De resulterende lab-on-a-chip-enheder giver unikke muligheder for spatiotemporal kontrol af molekyler med betydeligt reducerede prøvevolumener og multiplexeringskapacitet14. Talrige mikrofluidiske metoder til fremstilling af liposomer er blevet udviklet, herunder pulserende jetting15, dobbelt emulsionstemplating16, forbigående membranudstødning 17, dråbeemulsionsoverførsel 18 og hydrodynamisk fokusering 19. Disse teknikker producerer monodispergerede, unilamellære, cellestore liposomer med høj indkapslingseffektivitet og høj gennemstrømning.
Denne artikel beskriver proceduren for octanolassisteret liposomsamling (OLA), en on-chip mikrofluidisk metode baseret på den hydrodynamiske pinch-off og efterfølgende opløsningsmiddelaffugtningsmekanisme20 (figur 1). Man kan relatere OLA’s arbejde til en bobleblæsningsproces. Et seksvejs kryds fokuserer den indre vandige (IA) fase, to lipidbærende organiske (LO) strømme og to overfladeaktive indeholdende ydre vandige (OA) strømme på et enkelt sted. Dette resulterer i vand-i-(lipider + octanol)-i-vand dobbeltemulsionsdråber. Da disse dråber strømmer nedstrøms, fører grænsefladeenergiminimering, ekstern forskydningsstrøm og interaktion med kanalvæggene til dannelsen af et lipiddobbeltlag ved grænsefladen, når opløsningsmiddellommen løsnes og danner unilamellære liposomer. Afhængigt af størrelsen på oktanollommen kan affugtningsprocessen tage titusinder af sekunder til et par minutter. I slutningen af udgangskanalen flyder de mindre tætte oktanoldråber til overfladen, mens de tungere liposomer (på grund af en tættere indkapslet opløsning) synker til bunden af visualiseringskammeret klar til eksperimentering. Som et repræsentativt eksperiment demonstreres processen med væske-væskefaseseparation (LLPS) inde i liposomer. Til det er de nødvendige komponenter indkapslet inde i liposomer ved en sur pH, der forhindrer LLPS. Ved eksternt at udløse en pH-ændring og således en transmembran protonflux dannes faseseparerede kondensatdråber inde i liposomerne. Dette fremhæver OLA-systemets effektive indkapslings- og manipulationsfunktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellulær kompleksitet gør det ekstremt vanskeligt at forstå levende celler, når de studeres som helhed. Reduktion af redundans og sammenkobling af celler ved at rekonstituere nøglekomponenterne in vitro er nødvendig for at fremme vores forståelse af biologiske systemer og skabe kunstige cellulære efterligninger til bioteknologiske applikationer22,23,24. Liposomer tjener som et fremragende minimalt system til at forstå c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dolf Weijers, Vera Gorelova og Mark Roosjen for venligt at give os YFP. S.D. anerkender økonomisk støtte fra det hollandske forskningsråd (bevillingsnummer: OCENW. KLEIN.465).
Materials
| 1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
| 1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
| ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
| Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
| Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
| Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
| DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
| F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
| Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
| Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
| Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
| Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
| Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
| Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
| Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
| Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
| Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
| Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
| Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
| Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
| UV laser | 365 nm wavelength |
References
- Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
- Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
- Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
- Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
- Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
- van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
- Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
- Zhang, H., D’Souza, G. G. M. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. , 17-22 (2017).
- Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
- Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
- Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
- Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
- Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
- Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
- Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
- Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
- Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
- Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
- Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
- Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
- Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
- Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
- Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
- Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
- Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
- Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
- Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
- Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
- Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
- Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
- Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
- Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
- Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
- Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
- Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
- Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
- Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
- Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
- Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
- Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
- Banlaki, I., Lehr, F. -. X., Niederholtmeyer, H., Karim, A. S., Jewett, M. C. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. , 237-255 (2022).
