Summary

ATAC-Seq ספציפי לאדיפוציט עם רקמות שומן באמצעות מיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) במיוחד על אדיפוציטים באמצעות מיון גרעין עם רקמות שומן שבודדו מעכברי כתב טרנסגניים עם תיוג פלואורסצנטי גרעיני.

Abstract

בדיקה עבור כרומטין נגיש טרנספוזאז עם ריצוף תפוקה גבוהה (ATAC-seq) היא טכניקה חזקה המאפשרת פרופיל נגישות כרומטין ברחבי הגנום. טכניקה זו שימושית להבנת מנגנוני הבקרה של ביטוי גנים במגוון תהליכים ביולוגיים. למרות ATAC-seq כבר שונה עבור סוגים שונים של דגימות, לא היו שינויים יעילים של שיטות ATAC-seq עבור רקמות שומן. אתגרים עם רקמות שומן כוללים הטרוגניות תאית מורכבת, תכולת שומנים גדולה וזיהום מיטוכונדריאלי גבוה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט על ידי שימוש במיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות עם רקמות שומן מעכבר הכתב המהונדס Nuclear Taggging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). פרוטוקול זה מפיק נתונים באיכות גבוהה עם קריאות רצף מבוזבזות מינימליות תוך הפחתת כמות הקלט והריאגנטים של הגרעין. מאמר זה מספק הוראות מפורטות שלב אחר שלב עבור שיטת ATAC-seq שאומתה לשימוש בגרעיני אדיפוציט שבודדו מרקמות שומן עכבר. פרוטוקול זה יסייע בחקירת דינמיקת הכרומטין באדיפוציטים על גירויים ביולוגיים מגוונים, אשר יאפשרו תובנות ביולוגיות חדשות.

Introduction

רקמת שומן, המתמחה באחסון אנרגיה עודפת בצורה של מולקולות שומנים, היא איבר מפתח לוויסות מטבולי. הבקרה הקפדנית על היווצרות ותחזוקה של אדיפוציטים חיונית לתפקוד רקמת השומן ולהומאוסטזיס אנרגיה של כל הגוף1. רגולטורי שעתוק רבים ממלאים תפקיד קריטי בבקרת התמיינות האדיפוציטים, הפלסטיות והתפקוד; חלק מהרגולטורים הללו מעורבים בהפרעות מטבוליות בבני אדם 2,3. ההתקדמות האחרונה בטכניקות ריצוף בתפוקה גבוהה לביטוי גנים וניתוח אפיגנומי הקלה עוד יותר על גילוי הרגולטורים המולקולריים של ביולוגיה אדיפוציטית4. מחקרי פרופיל מולקולרי המשתמשים ברקמות שומן מאתגרים לביצוע בשל ההטרוגניות של רקמות אלה. רקמת השומן מורכבת בעיקר מאדיפוציטים, האחראים על אחסון שומן, אך מכילה גם סוגי תאים שונים אחרים, כגון פיברובלסטים, תאי אנדותל ותאי חיסון5. בנוסף, ההרכב התאי של רקמת השומן משתנה באופן דרמטי בתגובה לשינויים פתופיזיולוגיים כגון טמפרטורה ומצב תזונתי6. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו בעבר עכבר כתב מהונדס, בשם Nuclear Taggging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), המייצר ריבוזומים המתויגים על ידי GFP וגרעינים ביוטינילטים המתויגים על ידי mCherry באופן תלוי Cre רקומבינאז7. מערכת התיוג הכפול מאפשרת לבצע אנליזה שעתוק ואפיגנומי ספציפיים לסוג התא עם רקמות. באמצעות עכברי NuTRAP שחצו קווי אדיפונקטין-Cre ספציפיים לאדיפוציט (Adipoq-NuTRAP), אפיינו בעבר פרופילי ביטוי גנים ומצבי כרומטין מאוכלוסיות אדיפוציטים טהורות in vivo וקבענו כיצד הם משתנים במהלך השמנת יתר 7,8. בעבר, עכברי NuTRAP שחצו קווי Ucp1-Cre ספציפיים לאדיפוציט חום ובז’ (Ucp1-NuTRAP) אפשרו לנו לאפיין את העיצוב מחדש האפיגנומי של אוכלוסיית האדיפוציטים התרמוגניים הנדירים, אדיפוציטים בצבע בז’, בתגובה לשינויי טמפרטורה9.

ATAC-seq היא שיטה אנליטית נפוצה להערכת נגישות הכרומטין ברחבי הגנום. טרנספוזאז Tn5 היפר-תגובתי המשמש ב- ATAC-seq מאפשר זיהוי של אזורי כרומטין פתוחים על ידי תיוג מתאמי ריצוף באזור הנגיש לכרומטין, של גרעינים10. ATAC-seq היא שיטה פשוטה, אך היא מספקת תוצאות חזקות והיא יעילה מאוד גם עם דגימות קלט נמוך. בכך היא הפכה לאחת משיטות האפיגנומיות הפופולריות ביותר ותרמה להבנת מנגנוני הבקרה של ביטוי גנים בהקשרים ביולוגיים מגוונים. מאז שנוצר פרוטוקול ATAC-seq המקורי, פותחו טכניקות שונות הנגזרות מ- ATAC-seq כדי לשנות ולייעל את הפרוטוקול עבור סוגים שונים של דגימות. לדוגמה, Fast-ATAC מיועד לניתוח דגימות תאי דם11, Omni-ATAC הוא פרוטוקול אופטימלי לדגימות רקמות קפואות 12, ו- MiniATAC-seq יעיל לניתוח עוברים בשלב מוקדם13. עם זאת, יישום שיטת ATAC-seq על אדיפוציטים, במיוחד מדגימות רקמות, עדיין מאתגר. בנוסף להטרוגניות של רקמת השומן, תכולת השומנים הגבוהה שלה עלולה להפריע לתגובות רקומבינציה יעילות על ידי טרנספוזאז Tn5 גם לאחר בידוד הגרעין. יתר על כן, תכולת המיטוכונדריה הגבוהה באדיפוציטים, במיוחד באדיפוציטים חומים ובז’, גורמת לזיהום גבוה בדנ”א המיטוכונדריאלי ולבזבוז קריאות ריצוף. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט באמצעות עכברי Adipoq-NuTRAP (איור 1). על ידי ניצול מיון גרעינים עם תווית פלואורסצנטית, פרוטוקול זה מאפשר איסוף אוכלוסיות טהורות של גרעיני אדיפוציט הרחק מסוגי תאים מבלבלים אחרים והסרה יעילה של שומנים, מיטוכונדריה ופסולת רקמות. לפיכך, פרוטוקול זה יכול להפיק נתונים באיכות גבוהה ספציפיים לסוג התא ולמזער את הבזבוז מקריאות מיטוכונדריאליות תוך שימוש בכמות מופחתת של קלט וריאגנטים בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי.

Protocol

הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי נהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה. 1. הכנות לפני תחילת הניסוי הכנת רקמותעבור תיוג גרעין אדיפוציט, הצליבו עכברי NuTRAP עם קווי adiponectin-Cre ספציפיים לאדיפ?…

Representative Results

כדי לנתח רקמת שומן באמצעות פרוטוקול ATAC-seq זה, יצרנו עכברי Adipoq-NuTRAP שניזונו מתזונת צ’או; לאחר מכן בודדנו גרעיני אדיפוציט מרקמת השומן הלבן האפידידימלית (eWAT), מרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT) ומרקמת השומן החום (BAT) באמצעות ציטומטריית זרימה. הגרעינים המבודדים שימשו לתיוג, ולאחר מכן לטיהור DNA, הגברת PCR, ש…

Discussion

במאמר זה, הצגנו פרוטוקול ATAC-seq ממוטב להערכת נגישות כרומטין ספציפי לאדיפוציט in vivo. פרוטוקול ATAC-seq זה המשתמש בעכבר Adipoq-NuTRAP יצר בהצלחה פרופילי נגישות של כרומטין ספציפיים לאדיפוציט. הגורם הקריטי ביותר לניסויי ATAC-seq מוצלחים וניתנים לשחזור הוא איכות הגרעין. חשוב להקפיא מיד את רקמות השומן המנ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי IUSM Showalter Research Trust Fund (ל- H.C.R.), מרכז IUSM לסוכרת ומחלות מטבוליות פיילוט ומענק היתכנות (ל- H.C.R.), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK129289 ל- H.C.R.), ופרס הפקולטה הצעירה של האגודה האמריקאית לסוכרת (7-21-JDF-056 ל- H.C.R).

Materials

Animals
Adiponectin-Cre mouse The Jackson Laboratory 28020
NuTRAP mouse The Jackson Laboratory 29899
Reagents & Materials
1.5 mL DNA-LoBind tubes Eppendorf 86-923
100 µm cell strainer Falcon 352-360
15 mL tubes VWR 525-1071
2x TD buffer Illumina 15027866
384-well PCR plate Applied biosystem 4483285
40 µm cell strainer Falcon 352-340
50 mL tubes VWR 525-1077
AMPure XP reagent (SPRI beads) Beckman Coulter A63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit Agilent Technologies 5067-4626
Clear adhesive film Applied biosystem 4306311
DNase/RNase-free distilled water Invitrogen 10977015
Dounce tissue grinder DWK Life Sciences 357542
DTT Sigma D9779
DynaMag-96 side skirted magnet Thermo Fishers 12027
FACS tubes Falcon  28719128
HEPES Boston BioProducts BBH-75
Hoechst 33342 Invitrogen 2134015
KCl (2 M) Boston BioProducts MT-252
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips EpiCypher 10-0008
MgCl2 (1 M) Boston BioProducts MT-200
MinElute PCR purification kit Qiagen 28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix BioLabs M0541S
NP40 Thermo Fishers 28324
PCR 8-tube strip USA scientific 1402-4708
Protease inhibitor cocktail (100x) Thermo Fishers 78439
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851
Sucrose Sigma S0389-1KG
SYBR Green I (10,000x) Invitrogen S7563
TDE I enzyme Illumina 15027865
Instruments
Flow cytometer BD Biosciences FACSAria Fusion
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226
Real-Time PCR system Thermo Fishers QuantStudio 5

References

  1. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  2. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  3. Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
  4. Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
  5. Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
  6. Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
  7. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  8. Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
  9. Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
  10. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  11. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  12. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  13. Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
  14. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
  15. So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
  16. Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
  17. Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin’s hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).

Play Video

Cite This Article
Kim, K., Taleb, S., So, J., Wann, J., Cheol Roh, H. Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting. J. Vis. Exp. (193), e65033, doi:10.3791/65033 (2023).

View Video