Fluorescence-Activated Nucleus Sorting을 사용한 지방 조직을 사용한 지방 세포 특이적 ATAC-Seq
Summary
우리는 핵 형광 표지가 있는 형질전환 리포터 마우스에서 분리된 지방 조직으로 핵 분류를 사용하는 지방 세포에 특히 고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용하여 전치사 효소 접근 가능한 염색질 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
고처리량 염기서열 분석(ATAC-seq)을 통한 전이효소 접근 가능 염색질 분석은 게놈 차원의 염색질 접근성 프로파일링을 가능하게 하는 강력한 기술입니다. 이 기술은 다양한 생물학적 과정에서 유전자 발현의 조절 메커니즘을 이해하는 데 유용했습니다. ATAC-seq는 다양한 유형의 샘플에 대해 변형되었지만 지방 조직에 대한 ATAC-seq 방법의 효과적인 변형은 없었습니다. 지방 조직의 문제에는 복잡한 세포 이질성, 큰 지질 함량 및 높은 미토콘드리아 오염이 포함됩니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 형질전환 리포터 NuTRAP(Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Pification) 마우스의 지방 조직으로 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 지방 세포 특이적 ATAC-seq를 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 낭비되는 염기서열 분석 판독을 최소화하면서 핵 입력 및 시약의 양을 줄이면서 고품질 데이터를 생성합니다. 이 논문은 마우스 지방 조직에서 분리된 지방 세포 핵의 사용을 위해 검증된 ATAC-seq 방법에 대한 자세한 단계별 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 자극에 대한 지방 세포의 염색질 역학 조사에 도움이 될 것이며, 이는 새로운 생물학적 통찰력을 가능하게 할 것입니다.
Introduction
지질 분자의 형태로 과도한 에너지를 저장하는 데 특화된 지방 조직은 대사 조절의 핵심 기관입니다. 지방세포 형성 및 유지의 엄격한 제어는 지방 조직 기능과 전신 에너지 항상성에 매우 중요하다1. 많은 전사 조절자는 지방 세포 분화, 가소성 및 기능의 조절에 중요한 역할을 합니다. 이러한 조절인자 중 일부는 인간의 대사 장애와 관련이 있습니다 2,3. 유전자 발현 및 후성유전체학 분석을 위한 고처리량 염기서열 분석 기술의 최근 발전은 지방세포 생물학의 분자 조절인자의 발견을 더욱 용이하게 했다4. 지방 조직을 사용한 분자 프로파일링 연구는 이러한 조직의 이질성으로 인해 수행하기 어렵습니다. 지방 조직은 주로 지방 저장을 담당하는 지방 세포로 구성되지만 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포와 같은 다양한 다른 세포 유형도 포함합니다5. 또한, 지방조직의 세포 조성은 온도 및 영양 상태와 같은 병태생리학적 변화에 반응하여 극적으로 변화한다6. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 이전에 Cre 재조합효소 의존적 방식으로 GFP 태그 리보솜 및 mCherry 태그 바이오티닐화 핵을 생성하는 NuTRAP(Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification )이라는 이름의 형질전환 리포터 마우스를 개발했다7. 이중 라벨링 시스템을 통해 조직으로 세포 유형별 전사체 및 후성유전체 분석을 수행할 수 있습니다. 지방세포 특이적 아디포넥틴-Cre 계통(Adipoq-NuTRAP)과 교배된 NuTRAP 마우스를 사용하여 이전에 생체 내 순수 지방세포 집단의 유전자 발현 프로필과 염색질 상태를 특성화하고 비만 동안 어떻게 변경되는지 결정했습니다 7,8. 이전에는 갈색 및 베이지색 지방세포 특이적 Ucp1-Cre 라인(Ucp1-NuTRAP)과 교배된 NuTRAP 마우스를 통해 온도 변화에 반응하여 희귀한 열발생 지방세포 개체군인 베이지색 지방세포의 후성유전체 리모델링을 특성화할 수 있었다9.
ATAC-seq는 게놈 전체의 염색질 접근성을 평가하기 위해 널리 사용되는 분석 방법입니다. ATAC-seq에 사용되는 과반응성 Tn5 전이효소는 핵10의 염색질 접근 가능 영역에서 시퀀싱 어댑터를 태깅하여 개방 염색질 영역을 식별할 수 있습니다. ATAC-seq는 간단한 분석법이지만 강력한 결과를 제공하며 저투입 시료에서도 매우 효율적입니다. 따라서 가장 인기 있는 후성유전체 프로파일링 방법 중 하나가 되었으며 다양한 생물학적 맥락에서 유전자 발현의 조절 메커니즘을 이해하는 데 기여했습니다. 오리지널 ATAC-seq 프로토콜이 만들어진 이후, 다양한 유형의 샘플에 대한 프로토콜을 수정하고 최적화하기 위해 다양한 ATAC-seq 파생 기술이 추가로 개발되었습니다. 예를 들어, Fast-ATAC는 혈구 샘플(11)을 분석하기 위해 설계되었고, Omni-ATAC는 냉동 조직 샘플(12)에 최적화된 프로토콜이며, MiniATAC-seq는 초기 단계 배아 분석(13)에 효과적이다. 그러나 ATAC-seq 방법을 지방 세포, 특히 조직 샘플에 적용하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 지방 조직의 이질성 외에도 높은 지질 함량은 핵 분리 후에도 Tn5 전이효소에 의한 효율적인 재조합 반응을 방해할 수 있습니다. 또한, 지방 세포, 특히 갈색 및 베이지색 지방 세포의 높은 미토콘드리아 함량은 높은 미토콘드리아 DNA 오염을 유발하고 시퀀싱 판독을 낭비합니다. 이 논문은 Adipoq-NuTRAP 마우스를 사용한 지방세포 특이적 ATAC-seq에 대한 프로토콜을 설명합니다(그림 1). 형광 표지 핵 분류를 활용함으로써 이 프로토콜을 사용하면 다른 교란 세포 유형에서 분리된 순수 지방 세포 핵 집단을 수집하고 지질, 미토콘드리아 및 조직 파편을 효율적으로 제거할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 프로토콜에 비해 적은 양의 입력 및 시약을 사용하면서 세포 유형별 고품질 데이터를 생성하고 미토콘드리아 판독으로 인한 낭비를 최소화할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서 우리는 생체 내에서 지방 세포 특이적 염색질 접근성을 평가하기 위해 최적화된 ATAC-seq 프로토콜을 제시했습니다. Adipoq-NuTRAP 마우스를 사용하는 이 ATAC-seq 프로토콜은 지방 세포 특이적 염색질 접근성 프로파일을 성공적으로 생성했습니다. 성공적이고 재현 가능한 ATAC-seq 실험을 위한 가장 중요한 요소는 핵 품질입니다. 해부된 지방 조직을 액체 질소에서 즉시 급속 동결하고 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 IUSM Showalter Research Trust Fund (H.C.R.), IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 to H.C.R.) 및 American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 to H.C.R.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |
References
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