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환경과학

폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 정량화 및 전체 게놈 특성 분석

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65053
, , , , , , , , ,
1Institute of Sustainable Processes,University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology,University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology,National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS – School of Medicine and Biomedical Sciences,Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit),Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

이 프로토콜은 폐수 기반 역학 연구에 사용할 폐수 및 공기 샘플의 SARS-CoV-2 RNA를 정량화하고 실내 및 실외 에어로졸에서 SARS-CoV-2에 대한 노출 위험을 평가하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 또한 SARS-CoV-2 전체 게놈 특성 분석을 위한 타일형 앰플리콘 긴 템플릿 염기서열 분석 접근법을 설명합니다.

Abstract

폐수 기반 역학은 많은 국가에서 SARS-CoV-2 및 기타 전염병에 대한 유망하고 효과적인 감시 시스템으로 부상했습니다. 이 공정에는 일반적으로 폐수 농축, 핵산 추출, 선택된 게놈 세그먼트의 증폭, 증폭된 게놈 세그먼트의 검출 및 정량화가 포함됩니다. 이 방법론은 공기 샘플에서 SARS-CoV-2와 같은 감염원을 검출하고 정량화하는 데에도 유사하게 활용될 수 있습니다. 초기에 SARS-CoV-2는 주로 감염된 개인이 말, 재채기, 기침, 노래 부르기 또는 숨을 쉴 때 생성된 비말과의 밀접한 개인 접촉을 통해 확산되는 것으로 추정되었습니다. 그러나 점점 더 많은 연구에서 의료 시설의 공기 중에 SARS-CoV-2 RNA가 존재한다고 보고하여 공기 중 전파가 바이러스의 실행 가능한 경로임을 입증했습니다. 이 연구는 폐수 및 공기 샘플에서 바이러스의 환경 검출, 정량화 및 염기서열 분석을 용이하게 하기 위해 확립된 프로토콜의 복합체를 제시합니다.

Introduction

2019년 12월, 이전에 알려지지 않은 코로나바이러스인 SARS-CoV-21에 의해 발생하는 COVID-19라는 새로운 질병이 등장했습니다. 그로 인한 글로벌 팬데믹은 많은 사람들이 지역 사회에서 바이러스 전파 및 확산을 정확하게 평가하기 위해 검사를 필요로 하기 때문에 전 세계 임상 및 공중 보건 실험실에 상당한 도전을 제시했습니다. 그러나 많은 지역에서 적시에 공간적으로 포괄적인 방식으로 필요한 수준의 테스트를 달성하는 것은 경제적으로 실현 불가능하다 2,3. 개별 임상 진단을 기반으로 하는 현재의 감시 시스템은 증상의 심각도와 개별 보고뿐만 아니라 이러한 증상이 인구 4,5,6,7,8,9,10에서 유행하는 기존 질병과 겹치는 정도에 크게 의존합니다. 결과적으로, 무증상 사례의 수가 많다는 것은 질병 부담에 대한 현저한 과소평가에 기여한다 7,11.

이러한 문제로 인해 COVID-19 감시를 위한 폐수 기반 역학(WBE)이 보완적인 감시 전략으로 제안되었습니다. WBE는 2001년에 처음 기술되었으며12 처음에는 코카인 및 기타 불법 약물을 추적하는 데 사용되었다13. 이 접근법은 폐수에서 안정하고 인간에 의해 배설되는 모든 물질의 초기 농도를 계산할 수 있다는 가정에 의존합니다 8,12. WBE는 SARS-CoV-2 3,8,14,15,16에 대한 보완적이고 효율적인 감시 시스템으로 많은 국가에서 성공적으로 구현되었습니다. 수생 환경에서 인간 바이러스를 검출하는 대부분의 방법은 농축, 핵산 추출, 선택한 게놈 세그먼트(또는 세그먼트)의 증폭, 증폭된 게놈 세그먼트의 검출/정량화 단계를 따릅니다3.

SARS-CoV-2의 검출 및 정량을 위한 또 다른 중요한 환경은 공기 샘플입니다. 초기에 SARS-CoV-2는 주로 감염된 사람이 말하거나, 재채기하거나, 기침하거나, 노래하거나, 숨을 쉴 때 발생하는 에어로졸의 호흡기 비말과의 밀접한 개인 접촉을 통해 전염되는 것으로 생각되었다17. 그러나 여러 연구에서 공기 중, 특히 의료 시설 및 기타 밀폐된 공간에서 SARS-CoV-2 RNA의 존재를 보고하기 시작했습니다 18,19,20,21. SARS-CoV-2의 생존력에 대한 증거는 바이러스 농도가 충분히 높았을 때 병원 및 기타 밀폐된 공간의 실내에서 채취한 공기 샘플에서 발견되었습니다22,23,2 4. 실외 연구에서는 일반적으로 붐비는 실외 공간을 제외하고는 SARS-CoV-2의 증거가 발견되지 않았다 21,25,26,27,28,29. 현재 SARS-CoV-2의 공기 중 전파는 전파 방식으로 인식되고있다 30,31. 최근 문헌고찰 연구에 따르면 밀집된 지역 밖에서 공기 중 전염 위험이 최소화되는 실외와 강력한 감염원(예: 감염자 수)이 존재할 수 있는 환기가 잘 되지 않는 환경에서 더 큰 위험이 나타날 수 있는 실내 간의 차이를 보여줍니다. 최근의 종합 문헌고찰 연구에서는 실외 환경과 실내 환경, 특히 환기가 잘 되지 않는 밀집된 장소에서 공기 중 전염 위험 간에 상당한 차이가 있음을 강조했습니다. 이 연구는 바이러스 입자의 희석 및 분산을 위해 더 많은 양의 공기가 존재하는 실외 환경에서 공기 중 전염의 위험이 최소화됨을 나타낸다(32). 이러한 결과는 COVID-19와 관련된 공중 보건 정책 및 지침에 중요한 영향을 미칩니다. 정책 입안자는 실내와 실외 환경 간의 전염 위험의 상당한 차이를 인식함으로써 바이러스 확산을 완화하고 공중 보건을 보호하기 위한 보다 효과적인 전략을 개발할 수 있습니다.

다양한 환경 샘플에서 SARS-CoV-2의 검출, 정량화 및 염기서열 분석을 위한 다양한 방법과 프로토콜이 있습니다. 이 방법 기사는 다양한 용량 수준을 가진 실험실이 폐수 및 공기 샘플에서 바이러스의 환경 검출, 정량화 및 시퀀싱을 수행할 수 있도록 하는 잘 확립된 프로토콜의 조합을 제시하는 것을 목표로 합니다.

Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 다른 곳에서 발표되었으며 원래 방법에서 약간 수정된 내용이 포함되어 있습니다. 1. 폐수 수집 및 시료 전처리 참고: 환경 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 농도가 낮기 때문에 성공적인 검출을 위해서는 농도 단계의 구현이 중요합니다33,34,35. 여기에 설?…

Representative Results

표 3에 요약된 결과는 이 기사에 설명된 방법을 사용하여 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하고 정량화한 예를 보여줍니다. 폐수 샘플은 스페인과 슬로베니아의 폐수 처리장에서 수집되었으며 3번의 반복실험 중 최소 2번에서 Ct가 40 미만이면 양성으로 간주되었으며 Ct의 변동이 5% 미만인 경우 정량화가 유효한 것으로 간주되었습니다. 스페인과 포르투갈에서는 실내 및 실외 ?…

Discussion

(RT-)qPCR 방법을 사용한 미생물 및 바이러스 검출 및 정량화는 뛰어난 감도로 인해 널리 수용되고 있습니다. 그러나 이러한 기술은 환경 샘플을 분석할 때 많은 어려움에 직면합니다. 폐수 샘플에는 측정을 왜곡하고 오해의 소지가 있는 결과를 생성할 수 있는 억제 물질이 많이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하고 정밀도를 높이기 위해 복잡한 프로토콜이 고안, 설계 및 구현되었습니다. 이…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 Castilla y Leon 지방 정부와 FEDER 프로그램 (프로젝트 CLU 2017-09, UIC315 및 VA266P20)의 재정 지원으로 수행되었습니다.

Materials

Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit
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References

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Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).
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