이 프로토콜은 폐수 기반 역학 연구에 사용할 폐수 및 공기 샘플의 SARS-CoV-2 RNA를 정량화하고 실내 및 실외 에어로졸에서 SARS-CoV-2에 대한 노출 위험을 평가하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 또한 SARS-CoV-2 전체 게놈 특성 분석을 위한 타일형 앰플리콘 긴 템플릿 염기서열 분석 접근법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
폐수 기반 역학은 많은 국가에서 SARS-CoV-2 및 기타 전염병에 대한 유망하고 효과적인 감시 시스템으로 부상했습니다. 이 공정에는 일반적으로 폐수 농축, 핵산 추출, 선택된 게놈 세그먼트의 증폭, 증폭된 게놈 세그먼트의 검출 및 정량화가 포함됩니다. 이 방법론은 공기 샘플에서 SARS-CoV-2와 같은 감염원을 검출하고 정량화하는 데에도 유사하게 활용될 수 있습니다. 초기에 SARS-CoV-2는 주로 감염된 개인이 말, 재채기, 기침, 노래 부르기 또는 숨을 쉴 때 생성된 비말과의 밀접한 개인 접촉을 통해 확산되는 것으로 추정되었습니다. 그러나 점점 더 많은 연구에서 의료 시설의 공기 중에 SARS-CoV-2 RNA가 존재한다고 보고하여 공기 중 전파가 바이러스의 실행 가능한 경로임을 입증했습니다. 이 연구는 폐수 및 공기 샘플에서 바이러스의 환경 검출, 정량화 및 염기서열 분석을 용이하게 하기 위해 확립된 프로토콜의 복합체를 제시합니다.
서론
2019년 12월, 이전에 알려지지 않은 코로나바이러스인 SARS-CoV-21에 의해 발생하는 COVID-19라는 새로운 질병이 등장했습니다. 그로 인한 글로벌 팬데믹은 많은 사람들이 지역 사회에서 바이러스 전파 및 확산을 정확하게 평가하기 위해 검사를 필요로 하기 때문에 전 세계 임상 및 공중 보건 실험실에 상당한 도전을 제시했습니다. 그러나 많은 지역에서 적시에 공간적으로 포괄적인 방식으로 필요한 수준의 테스트를 달성하는 것은 경제적으로 실현 불가능하다 2,3. 개별 임상 진단을 기반으로 하는 현재의 감시 시스템은 증상의 심각도와 개별 보고뿐만 아니라 이러한 증상이 인구 4,5,6,7,8,9,10에서 유행하는 기존 질병과 겹치는 정....
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프로토콜
여기에 설명된 모든 방법은 다른 곳에서 발표되었으며 원래 방법에서 약간 수정된 내용이 포함되어 있습니다.
1. 폐수 수집 및 시료 전처리
참고: 환경 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 농도가 낮기 때문에 성공적인 검출을 위해서는 농도 단계의 구현이 중요합니다33,34,35. 여기에 설명된 것은 폐수36에서 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 최초로 보고된 방법입니다.
- 폐수 샘플의 수집 및 농축
- 1L의 24시간 복합 폐수 샘플을 수집합니다. 샘플을 4°C에서 보관하고 24시간 이내에 프로토콜을 진행합니다.
- 병을 부드럽게 흔들어 샘플을 균질화합니다. 70mL를 100mL 원심 튜브에 수집하거나 샘플을 50mL의 원심 튜브 2개로 나눕니다.
- 농축 공정의 내부 통제로 각 샘플의 70mL에 20μL의 mengovirus(3.2 x 103 copies/μL)를 스파이크합니다.....
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결과
표 3에 요약된 결과는 이 기사에 설명된 방법을 사용하여 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하고 정량화한 예를 보여줍니다. 폐수 샘플은 스페인과 슬로베니아의 폐수 처리장에서 수집되었으며 3번의 반복실험 중 최소 2번에서 Ct가 40 미만이면 양성으로 간주되었으며 Ct의 변동이 5% 미만인 경우 정량화가 유효한 것으로 간주되었습니다. 스페인과 포르투갈에서는 실내 및 실외 공기 샘플을 수집하여 동일한 규칙을 적용했습니다. 연구의 목적이 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는 것이지 정량화하는 것이 아니었기 때문에 폐수 샘플의 경우 삼중이 아닌 공기 샘플에 대해 복제본이 사용되었습니다. 또한, RT-qPCR 실행은 사용된 모든 대조군(이 프로토콜에 설명된 대로)이 예상대로 작동하고 mengovirus RNA 대조군에서 유의한 편차가 관찰되지 않은 경우에만 유효한 것으로 간주되었습니다. 이 샘플의 경우 멩고바이러스 회수 효율은 13.7%에서 19.7% 사이였습니다. 억제는 10배 및 1.......
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토론
(RT-)qPCR 방법을 사용한 미생물 및 바이러스 검출 및 정량화는 뛰어난 감도로 인해 널리 수용되고 있습니다. 그러나 이러한 기술은 환경 샘플을 분석할 때 많은 어려움에 직면합니다. 폐수 샘플에는 측정을 왜곡하고 오해의 소지가 있는 결과를 생성할 수 있는 억제 물질이 많이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하고 정밀도를 높이기 위해 복잡한 프로토콜이 고안, 설계 및 구현되었습니다. 이 프로토콜은 과학 문헌의 프로토콜을 결합하고 공정의 각 단계에서 일련의 엄격한 제어를 통합하여 qPCR 방법에 내재된 제한 사항을 구체적으로 해결함으로써 맞춤화되었습니다. 이러한 엄격한 품질 관리 조치를 통합함으로써 이 프로토콜은 복잡한 환경 시료51,52에서 qPCR 기반 검출 및 정량화 방법이 직면한 문제에 대한 강력한 솔루션을 제공합니다. 분리의 음성 제어(NCI) 및 비템플릿 제어(NTC)는 RNA 추출 및 RT-qPCR 반응 중 .......
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공개 사항
저자는 경제적 이익 또는 기타 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Castilla y Leon 지방 정부와 FEDER 프로그램 (프로젝트 CLU 2017-09, UIC315 및 VA266P20)의 재정 지원으로 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 어댑터+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 | 옥스포드 나노포어 | EXP-AMII001 | 염기서열분석 |
| AllPrep PowerViral DNA/RNA 키트 | Qiagen | 28000-50 | RNA 추출 키트 |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | PCR 정제, NGS 클린업, PCR 클린업 |
| ARTIC SARS-CoV-2 앰플리콘 패널 | IDT | 10011442 | SARS-CoV-2 게놈 증폭 |
| Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | 라이브러리 준비 |
| CENTRICON PLUS 70 10KDA. | Fisher Scientific | 10296062 | 집중 필터 |
| CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER | Bertin Technologies | 083-DU001 | 공기 샘플러 |
| Duran 실험실 병 | Merck | Z305200-10EA | 샘플링 병 |
| 플로우 셀 (R9.4.1) | Oxford Nanopore | FLO-MIN106D | 시퀀싱 |
| 일반 labarotory 소모품 (튜브, qPCR 플레이트 등) | |||
| 결찰 시퀀싱 키트 | Oxford Nanopore | SQK-LSK109 | 시퀀싱 |
| LunaScript RT SuperMix 키트 | NEB | E3010 | cDNA 합성 |
| Mengovirus 추출 제어 키트 | Biomé rieux | KMG | 농도 제어 |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermofisher | 5011-0012 | Sample storage |
| Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free | Oxford Nanopore | EXP-NBD104 | 바코드 |
| NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module | NEB | E7595 | DNA repair |
| NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes | NEB | E7658 | SARS-CoV-2 게놈 증폭 |
| NEBNext 빠른 결찰 반응 버퍼 | NEB | B6058S | 시퀀싱 |
| 인산염 완충 식염수 | Merck | P4474 | 수집 완충액 |
| 인산염 완충 식염수(PBS, 1X), 멸균 여과 | Thermofisher | J61196. 공기 | 샘플의 AP 용출 |
| Q5 핫스타트 하이파이도 2X 마스터 믹스 | NEB | M0494S | 핫스타트 DNA 중합효소 |
| Qubit RNA HS 어세이 키트 | Thermofisher | Q32852 | RNA 정량 |
| SARS-CoV-2 RUO qPCR 프라이머 및 프로브 키트, | IDT | 10006713 | 프라이머-프로브 믹스 및 qPCR 양성 대조군 |
| TaqPath 1-Step RT-qPCR 마스터 믹스 | Thermofisher | A15299 | RT-qPCR 키트 |
참고문헌
- Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
- Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http....
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재인쇄 및 허가
