Generación de ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema combinado de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado
Summary
En este protocolo, describimos los procedimientos técnicos para generar ratones knockout específicos para tejido adiposo marrón (BAT) aprovechando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado (AAV). Los pasos descritos incluyen el diseño de los sgRNAs, la preparación de las partículas AAV-sgRNA y la microinyección de AAV en los lóbulos BAT.
Abstract
El tejido adiposo marrón (BAT) es un depósito adiposo especializado en la disipación de energía que también puede servir como órgano endocrino a través de la secreción de moléculas bioactivas. La creación de ratones knockout específicos de BAT es uno de los enfoques más populares para comprender la contribución de un gen de interés a la regulación de energía mediada por BAT. La estrategia convencional de orientación génica que utiliza el sistema Cre-LoxP ha sido el enfoque principal para generar ratones knockout específicos de tejido. Sin embargo, este enfoque requiere mucho tiempo y es tedioso. Aquí, describimos un protocolo para la eliminación rápida y eficiente de un gen de interés en BAT utilizando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociados (AAV). El BAT interescapular se encuentra en la capa profunda entre los músculos. Por lo tanto, las MTD deben exponerse para inyectar el VAA de forma precisa y directa en las MTD dentro del campo visual. El manejo quirúrgico adecuado es crucial para prevenir el daño a los nervios y vasos simpáticos, como la vena de Sultzer que se conecta al BAT. Para minimizar el daño tisular, existe una necesidad crítica de comprender la ubicación anatómica tridimensional de las MTD y las habilidades quirúrgicas requeridas en los pasos técnicos. Este protocolo destaca los procedimientos técnicos clave, incluido el diseño de sgRNAs dirigidos al gen de interés, la preparación de partículas AAV-sgRNA y la cirugía para la microinyección directa de AAV en ambos lóbulos BAT para generar ratones knockout específicos de BAT, que se pueden aplicar ampliamente para estudiar las funciones biológicas de los genes en BAT.
Introduction
La obesidad está aumentando a un ritmo significativo en todo el mundo, lo que lleva a un amplio espectro de enfermedades metabólicas 1,2,3. El tejido adiposo es clave para estas patologías. Los dos tipos funcionalmente distintos de tejido adiposo que existen son el tejido adiposo blanco (WAT), que almacena el exceso de calorías, y el tejido adiposo marrón (BAT) y su grasa beige / brite relacionada, que disipa la energía para la termogénesis. Si bien el BAT ha sido reconocido por su función de disipación de energía, también tiene funciones endocrinas a través de la producción de moléculas bioactivas que regulan el metabolismo en los órganos distales 4,5. Numerosos estudios en roedores han demostrado que aumentar la cantidad o actividad de la grasa marrón o beige conduce a un mayor gasto de energía y una mejor sensibilidad a la insulina. En humanos, las personas con MTD detectable tienen una prevalencia significativamente menor de enfermedades cardiometabólicas6. Por lo tanto, las MTD tienen un excelente potencial terapéutico para las secuelas metabólicas relacionadas con la obesidad 7,8,9.
Para investigar la fisiología y fisiopatología del desarrollo y la función de las MTD y dilucidar los mecanismos moleculares implicados en estos procesos, el modelo de ratón transgénico específico para MTD es un método de elección10. El sistema de recombinación Cre-LoxP es el medio más utilizado para producir ratones knockout condicionales mediante la edición del genoma del ratón. Este sistema ha permitido la modificación (sobreexpresión o knockout) de genes de interés de manera específica de tejido/célula11. También se puede utilizar para etiquetar un tipo de célula específico mediante la expresión de un gen reportero fluorescente selectivo.
Recientemente, el enfoque del sistema Cre-LoxP se ha desarrollado aún más mediante la combinación de la tecnología CRISPR-Cas9 y el sistema de ARN de guía única (sgRNA) del virus adenoasociado (AAV)12. El sistema CRISPR-Cas9 es una herramienta de edición de genes específica y eficiente para modificar, regular o apuntar a regiones precisas del genoma13. La edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 permite una rápida manipulación genética de los loci genómicos porque no requiere una recombinación homóloga con un vector dirigido a genes. Las técnicas combinadas de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y AAV-sgRNA permiten a los investigadores comprender las funciones de los genes con mayor precisión al permitir la investigación del papel de los genes de interés en los momentos deseados en los tejidos / células. Además, estas técnicas combinadas reducen el tiempo y el esfuerzo requeridos para generar ratones transgénicos y permiten el control temporal de la actividad de CRISPR-Cas9 para la edición inducible del genoma en ratones si se utiliza una línea Cre inducible14.
Los vectores AAV son sistemas de administración de genes in vivo seguros y efectivos. Sin embargo, los AAV dirigidos al tejido adiposo se han quedado atrás de las aplicaciones en otros tejidos, como el cerebro, el corazón, el hígado y el músculo15. Debido a la eficiencia de transducción relativamente baja y al tropismo con vectores serotipos naturales, la entrega de genes guiados por AAV al tejido adiposo sigue siendo un desafío15. En los últimos 5 años, nosotros y otros hemos establecido con éxito formas efectivas y mínimamente invasivas de administrar genes guiados por AAV en el tejido adiposo y hemos creado modelos de ratón que nos permiten comprender los genes involucrados en la regulación de la función BAT16,17,18,19. Por ejemplo, al usar AAV8 para administrar sgRNA dirigido a Alox12, que codifica 12-lipoxigenasa (12-LOX), en el BAT de los ratones Ucp1-Cre / Cas9, hemos descubierto que BAT activado produce metabolitos 12-LOX, a saber, ácido 12-hidroxi-eicosapentaenoico (12-HEPE) y ácido 13R, 14S-dihidroxi docosahexaenoico (maresina 2), para regular el metabolismo de la glucosa y resolver la inflamación asociada a la obesidad, respectivamente16, 17. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso sobre los procedimientos técnicos, particularmente la cirugía para la microinyección directa de AAV-sgRNA en los lóbulos BAT, para generar ratones knockout específicos de BAT utilizando el sistema combinado Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y AAV-sgRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos publicados existentes para la administración de genes mediados por AAV a la MTD interescapular no contienen imágenes y videos detallados que describan las técnicas quirúrgicas y el enfoque para la inyección directa de AAV en el BAT. En la mayoría de los métodos publicados33,34, el AAV se inyecta en los tejidos grasos que rodean el MTD interescapular en lugar del propio MTD. Por lo tanto, hay varios pasos clave en este protocolo que determinan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones R01DK122808, R01DK102898 y R01DK132469 (a Y.-H.T.), así como P30DK036836 (al Centro de Investigación de la Diabetes del Centro de Diabetes Joslin). T. T. fue apoyado por la beca de investigación SUNSTAR (beca Hiroo Kaneda, Fundación Sunstar, Japón) y la 903968 de subvenciones de la American Heart Association. Y. Z. fue apoyado por Charles A. King Trust Fellowship. Agradecemos a Sean D. Kodani por revisar amablemente el manuscrito.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
