Generering af brune fedtspecifikke knockout-mus ved hjælp af et kombineret Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og adeno-associeret virus-single-guide-RNA-system
Summary
I denne protokol beskriver vi de tekniske procedurer til generering af brune fedtvæv (BAT)-specifikke knockout-mus, der udnytter et kombineret Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og adeno-associeret virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. De beskrevne trin omfatter design af sgRNA’erne, fremstilling af AAV-sgRNA-partiklerne og mikroinjektion af AAV i BAT-loberne.
Abstract
Brunt fedtvæv (BAT) er et fedtdepot specialiseret i energiafledning, der også kan tjene som et endokrin organ via udskillelsen af bioaktive molekyler. Oprettelsen af BAT-specifikke knockout-mus er en af de mest populære tilgange til at forstå bidraget fra et gen af interesse til BAT-medieret energiregulering. Den konventionelle genmålretningsstrategi, der bruger Cre-LoxP-systemet, har været den vigtigste tilgang til at generere vævsspecifikke knockout-mus. Denne tilgang er imidlertid tidskrævende og kedelig. Her beskriver vi en protokol til hurtig og effektiv knockout af et gen af interesse for BAT ved hjælp af et kombineret Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adeno-associeret virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system. Den interscapulære BAT er placeret i det dybe lag mellem musklerne. BAT skal således eksponeres for at injicere AAV præcist og direkte i BAT inden for synsfeltet. Passende kirurgisk håndtering er afgørende for at forhindre skade på de sympatiske nerver og kar, såsom Sultzers vene, der forbinder til BAT. For at minimere vævsskade er der et kritisk behov for at forstå den tredimensionelle anatomiske placering af BAT og de kirurgiske færdigheder, der kræves i de tekniske trin. Denne protokol fremhæver de vigtigste tekniske procedurer, herunder design af sgRNA’er rettet mod genet af interesse, forberedelse af AAV-sgRNA-partikler og kirurgi til direkte mikroinjektion af AAV i begge BAT-lobes til generering af BAT-specifikke knockout-mus, som bredt kan anvendes til at studere de biologiske funktioner af gener i BAT.
Introduction
Fedme stiger betydeligt på verdensplan, hvilket fører til et bredt spektrum af metaboliske sygdomme 1,2,3. Fedtvævet er nøglen til disse patologier. De to funktionelt forskellige typer fedtvæv, der findes, er hvidt fedtvæv (WAT), som lagrer overskydende kalorier, og brunt fedtvæv (BAT) og dets relaterede beige / brite fedt, som spreder energi til termogenese. Mens BAT er blevet anerkendt for sin energiafledende funktion, har den også endokrine funktioner via produktionen af bioaktive molekyler, der regulerer stofskiftet i distale organer 4,5. Talrige undersøgelser hos gnavere har vist, at forøgelse af mængden eller aktiviteten af brunt eller beige fedt fører til øget energiforbrug og forbedret insulinfølsomhed. Hos mennesker har mennesker med påviselig BAT en signifikant lavere forekomst af kardiometaboliske sygdomme6. BAT har således fremragende terapeutisk potentiale for fedmerelaterede metaboliske følgevirkninger 7,8,9.
For at undersøge fysiologien og patofysiologien af BAT’s udvikling og funktion og for at belyse de molekylære mekanismer, der er involveret i disse processer, er den BAT-specifikke transgene musemodel en metode til valg10. Cre-LoxP-rekombinationssystemet er det mest almindeligt anvendte middel til at producere betingede knockout-mus ved at redigere musegenomet. Dette system har muliggjort modifikation (overekspression eller knockout) af gener af interesse på en vævs-/cellespecifik måde11. Det kan også bruges til at mærke en bestemt celletype ved at udtrykke et selektivt fluorescerende reportergen.
For nylig er Cre-LoxP-systemtilgangen blevet videreudviklet ved at kombinere CRISPR-Cas9-teknologien og adeno-associeret virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) system12. CRISPR-Cas9-systemet er et specifikt og effektivt genredigeringsværktøj til at ændre, regulere eller målrette præcise regioner af genomet13. CRISPR-Cas9-baseret genomredigering muliggør hurtig genetisk manipulation af genomiske loci, fordi det ikke kræver homolog rekombination med en genmålretningsvektor. Kombinerede Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-teknikker gør det muligt for forskere at forstå genfunktioner mere præcist ved at tillade undersøgelse af rollen af gener af interesse på ønskede tidspunkter i væv / celler. Derudover reducerer disse kombinerede teknikker den tid og kræfter, der kræves for at generere transgene mus og tillader tidsmæssig kontrol af CRISPR-Cas9-aktivitet til inducerbar genomredigering i mus, hvis der anvendes en inducerbar Cre-linje14.
AAV-vektorer er sikre og effektive in vivo-genleveringssystemer. AAV’er rettet mod fedtvæv har imidlertid haltet bagefter applikationer i andre væv, såsom hjerne, hjerte, lever og muskel15. På grund af den relativt lave transduktionseffektivitet og tropisme med naturligt forekommende serotypevektorer er AAV-guidet genlevering til fedtvæv stadig udfordrende15. I løbet af de sidste 5 år har vi og andre med succes etableret effektive og minimalt invasive måder at levere AAV-guidede gener i fedtvæv og skabt musemodeller, der giver os mulighed for at få en forståelse af de gener, der er involveret i reguleringen af BAT-funktion16,17,18,19. For eksempel ved at bruge AAV8 til at levere sgRNA rettet mod Alox12, som koder for 12-lipoxygenase (12-LOX), i BAT hos Ucp1-Cre/Cas9-musene, har vi opdaget, at aktiveret BAT producerer 12-LOX-metabolitter, nemlig 12-hydroxy-eicosapentaensyre (12-HEPE) og 13R, 14S-dihydroxydocosahexaensyre (maresin 2), for at regulere glukosemetabolismen og løse fedme-associeret inflammation, henholdsvis16, 17. Her leverer vi en trin-for-trin protokol om de tekniske procedurer, især operationen til direkte mikroinjektion af AAV-sgRNA i BAT-lapperne, for at generere BAT-specifikke knockout-mus ved hjælp af det kombinerede Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og AAV-sgRNA-system.
Protocol
Representative Results
Discussion
De eksisterende offentliggjorte metoder til AAV-medieret genlevering til interscapular BAT indeholder ikke detaljerede billeder og videoer, der beskriver de kirurgiske teknikker og tilgang til direkte AAV-injektion i BAT. I de fleste af de offentliggjorte metoder33,34 injiceres AAV i fedtvævet omkring den interscapulære BAT i stedet for selve BAT. Derfor er der flere vigtige trin i denne protokol, der bestemmer undersøgelsens succes. Disse omfatter design af s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af US National Institutes of Health (NIH) tilskud R01DK122808, R01DK102898 og R01DK132469 (til Y.-H.T.) samt P30DK036836 (til Joslin Diabetes Center’s Diabetes Research Center). T. T. blev støttet af SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) og American Heart Association grant 903968. Y. Z. blev støttet af Charles A. King Trust Fellowship. Vi takker Sean D. Kodani for venligt at korrekturlæse manuskriptet.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
