Generatie van bruine vet-specifieke knock-out muizen met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en Adeno-geassocieerd virus single-guide RNA-systeem
Summary
In dit protocol beschrijven we de technische procedures om bruin vetweefsel (BAT)-specifieke knock-out muizen te genereren met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De beschreven stappen omvatten het ontwerp van de sgRNA’s, de bereiding van de AAV-sgRNA-deeltjes en de micro-injectie van AAV in de BBT-lobben.
Abstract
Bruin vetweefsel (BAT) is een vetdepot gespecialiseerd in energiedissipatie dat ook kan dienen als endocriene orgaan via de afscheiding van bioactieve moleculen. Het creëren van BAT-specifieke knock-outmuizen is een van de meest populaire benaderingen voor het begrijpen van de bijdrage van een gen van belang aan BAT-gemedieerde energieregulatie. De conventionele gen-targetingstrategie met behulp van het Cre-LoxP-systeem is de belangrijkste aanpak geweest om weefselspecifieke knock-outmuizen te genereren. Deze aanpak is echter tijdrovend en vervelend. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle en efficiënte knock-out van een gen van belang in BAT met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De interscapulaire BBT bevindt zich in de diepe laag tussen de spieren. De BBT moet dus worden blootgesteld om de AAV nauwkeurig en rechtstreeks in de BBT binnen het gezichtsveld te injecteren. Een goede chirurgische behandeling is cruciaal om schade aan de sympathische zenuwen en bloedvaten te voorkomen, zoals de ader van de Sultzer die verbinding maakt met de BAT. Om weefselschade te minimaliseren, is er een kritieke behoefte om de driedimensionale anatomische locatie van de BAT en de chirurgische vaardigheden die vereist zijn in de technische stappen te begrijpen. Dit protocol belicht de belangrijkste technische procedures, waaronder het ontwerp van sgRNA’s gericht op het gen van belang, de voorbereiding van AAV-sgRNA-deeltjes en de operatie voor de directe micro-injectie van AAV in beide BAT-lobben voor het genereren van BAT-specifieke knock-outmuizen, die breed kunnen worden toegepast om de biologische functies van genen in BBT te bestuderen.
Introduction
Obesitas neemt wereldwijd in een aanzienlijk tempo toe, wat leidt tot een breed spectrum van metabole ziekten 1,2,3. Het vetweefsel is de sleutel tot deze pathologieën. De twee functioneel verschillende soorten vetweefsel die er zijn, zijn wit vetweefsel (WAT), dat overtollige calorieën opslaat, en bruin vetweefsel (BAT) en het bijbehorende beige / brite-vet, dat energie afvoert voor thermogenese. Hoewel BAT is erkend voor zijn energiedissiperende functie, heeft het ook endocriene functies via de productie van bioactieve moleculen die het metabolisme in distale organen reguleren 4,5. Talrijke studies bij knaagdieren hebben aangetoond dat het verhogen van de hoeveelheid of activiteit van bruin of beige vet leidt tot een verhoogd energieverbruik en een verbeterde insulinegevoeligheid. Bij mensen hebben mensen met detecteerbare BBT een significant lagere prevalentie van cardiometabole ziekten6. BAT heeft dus een uitstekend therapeutisch potentieel voor obesitas-gerelateerde metabole sequelae 7,8,9.
Om de fysiologie en pathofysiologie van BBT-ontwikkeling en -functie te onderzoeken en de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij deze processen op te helderen, is het BBT-specifieke transgene muismodel een methode bij uitstek10. Het Cre-LoxP-recombinatiesysteem is het meest gebruikte middel om voorwaardelijke knock-outmuizen te produceren door het muizengenoom te bewerken. Dit systeem heeft de modificatie (overexpressie of knock-out) van genen van belang op een weefsel/ cel-specifieke manier mogelijkgemaakt 11. Het kan ook worden gebruikt om een specifiek celtype te labelen door een selectief fluorescerend reportergen tot expressie te brengen.
Onlangs is de Cre-LoxP-systeembenadering verder ontwikkeld door de CRISPR-Cas9-technologie te combineren met het adeno-geassocieerde virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) -systeem12. Het CRISPR-Cas9-systeem is een specifiek en efficiënt genbewerkingsinstrument om precieze regio’s van het genoom13 te wijzigen, te reguleren of te targeten. CRISPR-Cas9-gebaseerde genoombewerking maakt snelle genetische manipulatie van genomische loci mogelijk omdat het geen homologe recombinatie met een gen-targeting vector vereist. Gecombineerde Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- en AAV-sgRNA-technieken stellen onderzoekers in staat om genfuncties nauwkeuriger te begrijpen door onderzoek naar de rol van interessante genen op gewenste tijdstippen in weefsels / cellen mogelijk te maken. Bovendien verminderen deze gecombineerde technieken de tijd en moeite die nodig is om transgene muizen te genereren en maken ze de temporele controle van CRISPR-Cas9-activiteit mogelijk voor induceerbare genoombewerking bij muizen als een induceerbare Cre-lijn wordt gebruikt14.
AAV-vectoren zijn veilige en effectieve in vivo genafgiftesystemen. AAV’s gericht op vetweefsel zijn echter achtergebleven bij toepassingen in andere weefsels, zoals de hersenen, het hart, de lever en de spieren15. Vanwege de relatief lage transductie-efficiëntie en het tropisme met natuurlijk voorkomende serotypevectoren, is AAV-geleide genafgifte aan vetweefsel nog steeds een uitdaging15. In de afgelopen 5 jaar hebben wij en anderen met succes effectieve en minimaal invasieve manieren ontwikkeld om AAV-geleide genen in vetweefsel af te leveren en muismodellen gemaakt waarmee we inzicht kunnen krijgen in de genen die betrokken zijn bij de regulatie van BAT-functie16,17,18,19. Door bijvoorbeeld AAV8 te gebruiken om sgRNA gericht op Alox12, dat codeert voor 12-lipoxygenase (12-LOX), af te leveren in de BAT van de Ucp1-Cre / Cas9-muizen, hebben we ontdekt dat geactiveerde BAT 12-LOX-metabolieten produceert, namelijk 12-hydroxy-eicosapentaeenzuur (12-HEPE) en 13R, 14S-dihydroxydocosahexaeenzuur (maresine 2), om het glucosemetabolisme te reguleren en obesitas-geassocieerde ontstekingen op te lossen, respectievelijk16, 17. Hier bieden we een stapsgewijs protocol over de technische procedures, met name de operatie voor de directe micro-injectie van AAV-sgRNA in de BAT-lobben, om BAT-specifieke knock-outmuizen te genereren met behulp van het gecombineerde Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- en AAV-sgRNA-systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bestaande gepubliceerde methoden voor AAV-gemedieerde genafgifte aan de interscapulaire BBT bevatten geen gedetailleerde foto’s en video’s die de chirurgische technieken en aanpak voor directe AAV-injectie in de BBT beschrijven. In de meeste van de gepubliceerde methoden33,34 wordt de AAV geïnjecteerd in de vetweefsels rond de interscapulaire BBT in plaats van de BBT zelf. Daarom zijn er verschillende belangrijke stappen in dit protocol die het succes van de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) subsidies R01DK122808, R01DK102898 en R01DK132469 (aan Y.-H.T.), evenals P30DK036836 (aan het Diabetes Research Center van Joslin Diabetes Center). T.T. werd ondersteund door de SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan) en de American Heart Association grant 903968. Y.Z. werd ondersteund door de Charles A. King Trust Fellowship. We bedanken Sean D. Kodani voor het proeflezen van het manuscript.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
