Génération de souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système combiné d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé
Summary
Dans ce protocole, nous décrivons les procédures techniques pour générer des souris knockout spécifiques au tissu adipeux brun (MTD) en utilisant un système combiné d’ARN monoguide (ARNg) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé (AAV). Les étapes décrites comprennent la conception des ARNg, la préparation des particules AAV-sgRNA et la microinjection d’AAV dans les lobes BAT.
Abstract
Le tissu adipeux brun (MTD) est un dépôt adipeux spécialisé dans la dissipation d’énergie qui peut également servir d’organe endocrinien via la sécrétion de molécules bioactives. La création de souris knockout spécifiques aux MTD est l’une des approches les plus populaires pour comprendre la contribution d’un gène d’intérêt à la régulation énergétique médiée par les MTD. La stratégie conventionnelle de ciblage génique utilisant le système Cre-LoxP a été la principale approche pour générer des souris knockout spécifiques aux tissus. Cependant, cette approche est longue et fastidieuse. Ici, nous décrivons un protocole pour l’élimination rapide et efficace d’un gène d’intérêt dans la MTD à l’aide d’un système combiné de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et d’ARN monoguide (ARNg) du virus adéno-associé (AAV). La MTD interscapulaire est située dans la couche profonde entre les muscles. Ainsi, la MTD doit être exposée afin d’injecter l’AAV précisément et directement dans la MTD dans le champ visuel. Une manipulation chirurgicale appropriée est cruciale pour prévenir les dommages aux nerfs sympathiques et aux vaisseaux, tels que la veine de Sultzer qui se connecte à la MTD. Pour minimiser les lésions tissulaires, il est essentiel de comprendre l’emplacement anatomique tridimensionnel de la MTD et les compétences chirurgicales requises dans les étapes techniques. Ce protocole met en évidence les procédures techniques clés, y compris la conception d’ARNg ciblant le gène d’intérêt, la préparation de particules AAV-sgRNA et la chirurgie pour la microinjection directe d’AAV dans les deux lobes BAT pour générer des souris knockout spécifiques aux MTD, qui peuvent être largement appliquées pour étudier les fonctions biologiques des gènes dans les MTD.
Introduction
L’obésité augmente à un rythme significatif dans le monde entier, entraînant un large éventail de maladies métaboliques 1,2,3. Le tissu adipeux est la clé de ces pathologies. Les deux types de tissu adipeux fonctionnellement distincts qui existent sont le tissu adipeux blanc (WAT), qui stocke l’excès de calories, et le tissu adipeux brun (MTD) et sa graisse beige / brite associée, qui dissipe l’énergie pour la thermogenèse. Bien que la MTD ait été reconnue pour sa fonction de dissipation d’énergie, elle a également des fonctions endocriniennes via la production de molécules bioactives qui régulent le métabolisme dans les organes distaux 4,5. De nombreuses études chez les rongeurs ont démontré que l’augmentation de la quantité ou de l’activité de graisse brune ou beige entraîne une augmentation de la dépense énergétique et une amélioration de la sensibilité à l’insuline. Chez l’homme, les personnes atteintes de MTD détectables ont une prévalence significativement plus faible de maladies cardiométaboliques6. Ainsi, la MTD présente un excellent potentiel thérapeutique pour les séquelles métaboliques liées à l’obésité 7,8,9.
Pour étudier la physiologie et la physiopathologie du développement et de la fonction des MTD et élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans ces processus, le modèle murin transgénique spécifique aux MTD est une méthode de choix10. Le système de recombinaison Cre-LoxP est le moyen le plus couramment utilisé pour produire des souris knockout conditionnelles en modifiant le génome de la souris. Ce système a permis la modification (surexpression ou knockout) de gènes d’intérêt d’une manière spécifique aux tissus/cellules11. Il peut également être utilisé pour marquer un type de cellule spécifique en exprimant un gène rapporteur fluorescent sélectif.
Récemment, l’approche du système Cre-LoxP a été développée en combinant la technologie CRISPR-Cas9 et le système d’ARN monoguide (ARNg) du virus adéno-associé (AAV)12. Le système CRISPR-Cas9 est un outil d’édition de gènes spécifique et efficace pour modifier, réguler ou cibler des régions précises du génome13. L’édition du génome basée sur CRISPR-Cas9 permet une manipulation génétique rapide des loci génomiques car elle ne nécessite pas de recombinaison homologue avec un vecteur de ciblage gène. Les techniques combinées Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et AAV-sgRNA permettent aux chercheurs de comprendre plus précisément les fonctions des gènes en permettant d’étudier le rôle des gènes d’intérêt à des moments souhaités dans les tissus / cellules. De plus, ces techniques combinées réduisent le temps et les efforts nécessaires pour générer des souris transgéniques et permettent le contrôle temporel de l’activité de CRISPR-Cas9 pour l’édition inductible du génome chez la souris si une lignée Cre inductible est utilisée14.
Les vecteurs AAV sont des systèmes d’administration de gènes in vivo sûrs et efficaces. Cependant, les AAV ciblant le tissu adipeux ont pris du retard par rapport aux applications dans d’autres tissus, tels que le cerveau, le cœur, le foie et les muscles15. En raison de l’efficacité de transduction et du tropisme relativement faibles avec les vecteurs de sérotypes naturels, l’administration de gènes guidée par AAV au tissu adipeux est toujours difficile15. Au cours des 5 dernières années, nous et d’autres avons réussi à établir des moyens efficaces et peu invasifs de délivrer des gènes guidés par AAV dans le tissu adipeux et avons créé des modèles murins qui nous permettent de mieux comprendre les gènes impliqués dans la régulation de la fonction BAT16,17,18,19. Par exemple, en utilisant AAV8 pour délivrer de l’ARNg ciblant Alox12, qui code pour la 12-lipoxygénase (12-LOX), dans la MTD des souris Ucp1-Cre/Cas9, nous avons découvert que la MTD activée produit des métabolites 12-LOX, à savoir l’acide 12-hydroxy-eicosapentaénoïque (12-HEPE) et l’acide 13R, 14S-dihydroxy docosahexaénoïque (marésine 2), pour réguler le métabolisme du glucose et résoudre l’inflammation associée à l’obésité, respectivement16, 17. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape sur les procédures techniques, en particulier la chirurgie pour la micro-injection directe d’AAV-sgRNA dans les lobes BAT, pour générer des souris knockout spécifiques à la MTD en utilisant le système combiné Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et AAV-sgRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes publiées existantes pour l’administration de gènes médiés par AAV à la MTD interscapulaire ne contiennent pas d’images et de vidéos détaillées décrivant les techniques chirurgicales et l’approche pour l’injection directe d’AAV dans la MTD. Dans la plupart des méthodes publiées33,34, l’AAV est injecté dans les tissus adipeux entourant la MTD interscapulaire au lieu de la MTD elle-même. Par conséquent, il y a plusieurs étape…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par les subventions R01DK122808, R01DK102898 et R01DK132469 des National Institutes of Health (aux États-Unis), ainsi que P30DK036836 (au Centre de recherche sur le diabète du Joslin Diabetes Center). T. T. a été soutenu par la bourse de recherche SUNSTAR (bourse Hiroo Kaneda, Fondation Sunstar, Japon) et la subvention de l’American Heart Association 903968. Y. Z. a été soutenu par le Charles A. King Trust Fellowship. Nous remercions Sean D. Kodani d’avoir bien voulu relire le manuscrit.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
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