Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems
Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir die technischen Verfahren zur Erzeugung von braunem Fettgewebe (BAT)-spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems. Die beschriebenen Schritte umfassen das Design der sgRNAs, die Herstellung der AAV-sgRNA-Partikel und die Mikroinjektion von AAV in die BAT-Lappen.
Abstract
Braunes Fettgewebe (BAT) ist ein auf Energiedissipation spezialisiertes Fettdepot, das über die Sekretion bioaktiver Moleküle auch als endokrines Organ dienen kann. Die Züchtung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen ist einer der populärsten Ansätze, um den Beitrag eines Gens von Interesse zur BVT-vermittelten Energieregulation zu verstehen. Die konventionelle Gen-Targeting-Strategie unter Verwendung des Cre-LoxP-Systems war der Hauptansatz, um gewebespezifische Knockout-Mäuse zu erzeugen. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für den schnellen und effizienten Knockout eines Gens, das für BAT von Interesse ist, unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Single-Guide-RNA (sgRNA)-Systems. Die BAT interscapularis befindet sich in der tiefen Schicht zwischen den Muskeln. Daher muss die BVT freigelegt werden, um die AAV präzise und direkt in die BVT innerhalb des Gesichtsfeldes zu injizieren. Eine angemessene chirurgische Behandlung ist entscheidend, um Schäden an den sympathischen Nerven und Gefäßen zu vermeiden, wie z. B. der Sultzer-Vene, die mit dem BAT verbunden ist. Um Gewebeschäden zu minimieren, ist es von entscheidender Bedeutung, die dreidimensionale anatomische Lage des BVT und die chirurgischen Fähigkeiten, die in den technischen Schritten erforderlich sind, zu verstehen. Dieses Protokoll hebt die wichtigsten technischen Verfahren hervor, einschließlich des Designs von sgRNAs, die auf das interessierende Gen abzielen, der Herstellung von AAV-sgRNA-Partikeln und der Operation für die direkte Mikroinjektion von AAV in beide BAT-Lappen zur Erzeugung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen, die breit angewendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen in BAT zu untersuchen.
Introduction
Adipositas nimmt weltweit deutlich zu und führt zu einem breiten Spektrum von Stoffwechselerkrankungen 1,2,3. Das Fettgewebe ist der Schlüssel zu diesen Pathologien. Die beiden funktionell unterschiedlichen Arten von Fettgewebe, die es gibt, sind weißes Fettgewebe (WAT), das überschüssige Kalorien speichert, und braunes Fettgewebe (BAT) und das damit verbundene beige/britische Fett, das Energie für die Thermogenese abführt. Während BAT für seine energieableitende Funktion anerkannt ist, hat es auch endokrine Funktionen durch die Produktion bioaktiver Moleküle, die den Stoffwechsel in distalen Organen regulieren 4,5. Zahlreiche Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Menge oder Aktivität von braunem oder beigem Fett zu einem erhöhten Energieverbrauch und einer verbesserten Insulinsensitivität führt. Beim Menschen haben Menschen mit nachweisbarer BAT eine signifikant geringere Prävalenz von kardiometabolischen Erkrankungen6. Somit birgt BAT ein ausgezeichnetes therapeutisches Potenzial für Adipositas-bedingte metabolische Folgeerkrankungen 7,8,9.
Um die Physiologie und Pathophysiologie der BAT-Entwicklung und -Funktion zu untersuchen und die molekularen Mechanismen aufzuklären, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist das BVT-spezifische transgene Mausmodell eine Methode der Wahl10. Das Cre-LoxP-Rekombinationssystem ist die am häufigsten verwendete Methode, um bedingte Knockout-Mäuse durch Editierung des Mausgenoms zu erzeugen. Dieses System hat die Modifikation (Überexpression oder Knockout) von Genen von Interesse auf gewebe-/zellspezifische Weise ermöglicht11. Es kann auch verwendet werden, um einen bestimmten Zelltyp zu markieren, indem ein selektives fluoreszierendes Reportergen exprimiert wird.
In jüngster Zeit wurde der Cre-LoxP-Systemansatz durch die Kombination der CRISPR-Cas9-Technologie und des Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems weiterentwickelt12. Das CRISPR-Cas9-System ist ein spezifisches und effizientes Werkzeug zur Genom-Editierung, um bestimmte Regionen des Genoms zu modifizieren, zu regulieren oder gezielt anzusprechen13. Die CRISPR-Cas9-basierte Genom-Editierung ermöglicht eine schnelle genetische Manipulation genomischer Loci, da sie keine homologe Rekombination mit einem Gen-Targeting-Vektor erfordert. Kombinierte Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und AAV-sgRNA-Techniken ermöglichen es Forschern, Genfunktionen genauer zu verstehen, indem sie die Untersuchung der Rolle von Genen von Interesse zu gewünschten Zeitpunkten in Geweben/Zellen ermöglichen. Darüber hinaus reduzieren diese kombinierten Techniken den Zeit- und Arbeitsaufwand für die Erzeugung transgener Mäuse und ermöglichen die zeitliche Kontrolle der CRISPR-Cas9-Aktivität für die induzierbare Genom-Editierung in Mäusen, wenn eine induzierbare Cre-Linie verwendet wird14.
AAV-Vektoren sind sichere und effektive In-vivo-Gentransfersysteme. AAVs, die auf Fettgewebe abzielen, hinken jedoch der Anwendung in anderen Geweben wie Gehirn, Herz, Leber und Muskel hinterher15. Aufgrund der relativ geringen Transduktionseffizienz und des Tropismus mit natürlich vorkommenden Serotyp-Vektoren ist der AAV-gesteuerte Gentransport in das Fettgewebe nach wie vor eine Herausforderung15. In den letzten 5 Jahren haben wir und andere erfolgreich effektive und minimalinvasive Wege etabliert, um AAV-gesteuerte Gene in das Fettgewebe einzuschleusen, und Mausmodelle erstellt, die es uns ermöglichen, ein Verständnis der Gene zu erlangen, die an der Regulation der BAT-Funktion beteiligt sind16,17,18,19. Zum Beispiel haben wir durch die Verwendung von AAV8 zur Einschleusung von sgRNA, die auf Alox12 abzielt, die für 12-Lipoxygenase (12-LOX) kodiert, in die BAT der Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse entdeckt, dass aktivierte BAT 12-LOX-Metaboliten produziert, nämlich 12-Hydroxy-Eicosapentaensäure (12-HEPE) und 13R, 14S-Dihydroxydocosahexaensäure (Maresin 2), um den Glukosestoffwechsel zu regulieren bzw. Adipositas-assoziierte Entzündungen zu beheben16. 17. Der Teufel Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zu den technischen Verfahren zur Verfügung, insbesondere zur Operation zur direkten Mikroinjektion von AAV-sgRNA in die BAT-Lappen, um BAT-spezifische Knockout-Mäuse mit dem kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und AAV-sgRNA-System zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die existierenden veröffentlichten Methoden für den AAV-vermittelten Gentransfer in den interscapularären BAT enthalten keine detaillierten Bilder und Videos, die die Operationstechniken und den Ansatz für die direkte AAV-Injektion in den BVT beschreiben. Bei den meisten publizierten Methoden33,34 wird das AAV in das Fettgewebe injiziert, das die interscapularäre BAT umgibt, und nicht in die BVT selbst. Daher gibt es mehrere wichtige Schritte in diesem Proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch die Zuschüsse der U.S. National Institutes of Health (NIH) R01DK122808, R01DK102898 und R01DK132469 (an Y.-H.T.) sowie P30DK036836 (an das Diabetes Research Center des Joslin Diabetes Center) unterstützt. T. T. wurde durch das SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Stipendium, Sunstar Foundation, Japan) und das Stipendium der American Heart Association 903968 unterstützt. Y. Z. wurde durch das Charles A. King Trust Fellowship unterstützt. Wir danken Sean D. Kodani für das freundliche Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
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