יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליכים הטכניים ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמת שומן חומה (BAT) הממנפים מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו- ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). השלבים המתוארים כוללים את התכנון של sgRNAs, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, ואת microinjection של AAV לתוך אונות BAT.
Abstract
רקמת שומן חומה (BAT) היא מחסן שומן המתמחה בפיזור אנרגיה שיכול לשמש גם כאיבר אנדוקריני באמצעות הפרשת מולקולות ביו-אקטיביות. יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT היא אחת הגישות הפופולריות ביותר להבנת תרומתו של גן מעניין לוויסות אנרגיה בתיווך BAT. אסטרטגיית מיקוד הגנים הקונבנציונלית המשתמשת במערכת Cre-LoxP הייתה הגישה העיקרית ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמות. עם זאת, גישה זו גוזלת זמן ומייגעת. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לנוקאאוט מהיר ויעיל של גן בעל עניין ב-BAT באמצעות מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). ה- BAT interscapular ממוקם בשכבה העמוקה בין השרירים. לכן, ה-BAT חייב להיות חשוף על מנת להזריק את ה-AAV בצורה מדויקת וישירה לתוך ה-BAT בתוך שדה הראייה. טיפול כירורגי מתאים הוא חיוני למניעת נזק לעצבים ולכלי הדם הסימפתטיים, כגון וריד הזולצר המתחבר ל- BAT. כדי למזער את הנזק לרקמות, יש צורך קריטי להבין את המיקום האנטומי התלת מימדי של ה- BAT ואת המיומנויות הכירורגיות הנדרשות בשלבים הטכניים. פרוטוקול זה מדגיש את ההליכים הטכניים העיקריים, כולל תכנון sgRNA המכוון לגן המעניין, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, והניתוח למיקרו-הזרקה ישירה של AAV לשתי אונות BAT ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT, שניתן ליישם באופן נרחב כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של גנים ב-BAT.
Introduction
השמנת יתר עולה בקצב משמעותי ברחבי העולם, מה שמוביל למגוון רחב של מחלות מטבוליות 1,2,3. רקמת השומן היא המפתח לפתולוגיות אלה. שני הסוגים השונים מבחינה תפקודית של רקמת השומן הקיימים הם רקמת השומן הלבנה (WAT), המאחסנת קלוריות עודפות, ורקמת השומן החומה (BAT) ושומן הבז’/בריט הקשור אליה, המפזרים אנרגיה לצורך תרמוגנזה. בעוד BAT כבר מוכר על תפקוד פיזור האנרגיה שלה, יש לו גם פונקציות אנדוקריניות באמצעות ייצור של מולקולות ביו-אקטיביות המווסתות את חילוף החומרים באיברים דיסטליים 4,5. מחקרים רבים במכרסמים הוכיחו כי הגדלת כמות או פעילות השומן החום או הבז’ מובילה להוצאה אנרגטית מוגברת ולשיפור הרגישות לאינסולין. בבני אדם, אנשים עם BAT לגילוי יש שכיחות נמוכה משמעותית של מחלות cardiometabolic6. לפיכך, BAT טומן בחובו פוטנציאל טיפולי מצוין עבור sequelae מטבולי הקשור להשמנת יתר 7,8,9.
כדי לחקור את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של התפתחות ותפקוד BAT ולהבהיר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בתהליכים אלה, מודל העכבר המהונדס הספציפי ל-BAT הוא שיטה לבחירה10. מערכת הרקומבינציה Cre-LoxP היא האמצעי הנפוץ ביותר לייצור עכברי נוקאאוט מותנה על ידי עריכת גנום העכבר. מערכת זו אפשרה שינוי (ביטוי יתר או נוקאאוט) של גנים בעלי עניין באופן ספציפי לרקמה/תא11. ניתן להשתמש בו גם כדי לתייג סוג תא מסוים על ידי ביטוי גן כתב פלואורסצנטי סלקטיבי.
לאחרונה, גישת מערכת Cre-LoxP פותחה עוד יותר על ידי שילוב של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 ומערכת RNA (sgRNA)12 הקשורה לווירוס אדנו (AAV). מערכת CRISPR-Cas9 היא כלי ספציפי ויעיל לעריכת גנים כדי לשנות, לווסת או להתמקד באזורים מדויקים של גנום13. עריכת גנום מבוססת CRISPR-Cas9 מאפשרת מניפולציה גנטית מהירה של אתרים גנומיים מכיוון שהיא אינה דורשת רקומבינציה הומולוגית עם וקטור מיקוד גנים. טכניקות משולבות של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-AAV-sgRNA מאפשרות לחוקרים להבין את תפקודי הגנים בצורה מדויקת יותר בכך שהן מאפשרות לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בזמנים רצויים ברקמות/תאים. בנוסף, טכניקות משולבות אלה מפחיתות את הזמן והמאמץ הנדרשים ליצירת עכברים טרנסגניים ומאפשרות בקרה זמנית של פעילות CRISPR-Cas9 לעריכת גנום אינדוקטיבי בעכברים אם נעשה שימוש בקו Cre מושרה14.
וקטורי AAV בטוחים ויעילים במערכות העברת גנים vivo. עם זאת, AAVs המכוונים לרקמת שומן פיגרו אחרי יישומים ברקמות אחרות, כגון המוח, הלב, הכבד ושריר15. בשל יעילות ההולכה הנמוכה יחסית והטרופיזם עם וקטורי סרוטיפ טבעיים, העברת גנים מונחי AAV לרקמת השומן עדיין מאתגרת15. במהלך 5 השנים האחרונות, אנו ואחרים ביססנו בהצלחה דרכים יעילות וזעיר פולשניות להעברת גנים מונחי AAV לרקמת השומן ויצרנו מודלים עכבריים המאפשרים לנו להבין את הגנים המעורבים בוויסות תפקוד BAT16,17,18,19. לדוגמה, על ידי שימוש ב- AAV8 כדי לספק sgRNA המכוון ל- Alox12, המקודד 12-lipoxygenase (12-LOX), לתוך ה- BAT של עכברי Ucp1-Cre/Cas9, גילינו כי BAT פעיל מייצר מטבוליטים של 12-LOX, כלומר 12-hydroxy-eicosapentaenoic acid (12-HEPE) ו- 13R, 14S-dihydroxy docosahexaenoic acid (maresin 2), כדי לווסת את חילוף החומרים של גלוקוז ולפתור דלקת הקשורה להשמנת יתר, בהתאמה16, 17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב על ההליכים הטכניים, במיוחד הניתוח למיקרו-הזרקה ישירה של AAV-sgRNA לאונות העטלף, כדי ליצור עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT באמצעות מערכת Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-AAV-sgRNA המשולבת.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות הקיימות שפורסמו להעברת גנים בתיווך AAV ל- BAT interscapular אינן מכילות תמונות וסרטונים מפורטים המתארים את טכניקות הניתוח ואת הגישה להזרקת AAV ישירה ל- BAT. ברוב השיטות שפורסמו33,34, AAV מוזרק לתוך רקמות השומן סביב BAT interscapular במקום BAT עצמו. לפיכך, ישנם מספר שלבים מרכזי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות של ארה”ב (NIH) R01DK122808, R01DK102898 ו-R01DK132469 (ל-Y.-H.T.), כמו גם P30DK036836 (למרכז לחקר הסוכרת של מרכז ג’וסלין). T. T. נתמך על ידי מלגת המחקר SUNSTAR (מלגת Hiroo Kaneda, קרן Sunstar, יפן) ומענק איגוד הלב האמריקאי 903968. י.ז. נתמך על ידי מלגת קרן צ’ארלס א. קינג. אנו מודים לשון ד. קודאני על ההגהה האדיבה של כתב היד.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
