संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9, और एडेनो-एसोसिएटेड वायरस सिंगल-गाइड आरएनए सिस्टम का उपयोग करके ब्राउन फैट-विशिष्ट नॉकआउट चूहों की पीढ़ी
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) -विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए तकनीकी प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं, जो एक संयुक्त क्रे-लॉक्सपी, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9, और एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) प्रणाली का लाभ उठाते हैं। वर्णित चरणों में एसजीआरएनए का डिजाइन, एएवी-एसजीआरएनए कणों की तैयारी और बीएटी लोब में एएवी का माइक्रोइंजेक्शन शामिल है।
Abstract
ब्राउन एडीपोज ऊतक (बीएटी) ऊर्जा अपव्यय में विशिष्ट एक वसा डिपो है जो बायोएक्टिव अणुओं के स्राव के माध्यम से अंतःस्रावी अंग के रूप में भी काम कर सकता है। बीएटी-विशिष्ट नॉकआउट चूहों का निर्माण बीएटी-मध्यस्थता ऊर्जा विनियमन के लिए रुचि के जीन के योगदान को समझने के लिए सबसे लोकप्रिय दृष्टिकोणों में से एक है। क्रे-लॉक्सपी प्रणाली का उपयोग करके पारंपरिक जीन लक्ष्यीकरण रणनीति ऊतक-विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए प्रमुख दृष्टिकोण रहा है। हालांकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला और थकाऊ है। यहां, हम एक संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-कैस 9, और एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) प्रणाली का उपयोग करके बीएटी में रुचि के जीन के तेजी से और कुशल नॉकआउट के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इंटरस्केपुलर बैट मांसपेशियों के बीच गहरी परत में स्थित है। इस प्रकार, दृश्य क्षेत्र के भीतर एएवी को सटीक रूप से और सीधे बैट में इंजेक्ट करने के लिए बीएटी को उजागर किया जाना चाहिए। सहानुभूति तंत्रिकाओं और वाहिकाओं को नुकसान को रोकने के लिए उचित सर्जिकल हैंडलिंग महत्वपूर्ण है, जैसे कि सल्त्ज़र की नस जो बीएटी से जुड़ती है। ऊतक क्षति को कम करने के लिए, बीएटी के त्रि-आयामी शारीरिक स्थान और तकनीकी चरणों में आवश्यक सर्जिकल कौशल को समझने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल प्रमुख तकनीकी प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालता है, जिसमें रुचि के जीन को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए के डिजाइन, एएवी-एसजीआरएनए कणों की तैयारी, और बीएटी-विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए दोनों बीएटी लोब में एएवी के प्रत्यक्ष माइक्रोइंजेक्शन के लिए सर्जरी शामिल है, जिसे मोटे तौर पर बीएटी में जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
मोटापा दुनिया भर में एक महत्वपूर्ण दर से बढ़ रहा है, जिससे चयापचय रोगों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम 1,2,3 हो रहा है। वसा ऊतक इन विकृतियों के लिए महत्वपूर्ण है। दो कार्यात्मक रूप से अलग-अलग प्रकार के वसा ऊतक जो मौजूद हैं वे सफेद वसा ऊतक (डब्ल्यूएटी) हैं, जो अतिरिक्त कैलोरी संग्रहीत करते हैं, और भूरे रंग के वसा ऊतक (बीएटी) और इसके संबंधित बेज / ब्राइट वसा, जो थर्मोजेनेसिस के लिए ऊर्जा को नष्ट करते हैं। जबकि बीएटी को इसके ऊर्जा-विघटन कार्य के लिए मान्यता दी गई है, इसमें बायोएक्टिव अणुओं के उत्पादन के माध्यम से अंतःस्रावी कार्य भी हैं जो डिस्टलअंगों में चयापचय को नियंत्रित करते हैं। कृन्तकों में कई अध्ययनों से पता चला है कि भूरे या बेज वसा की मात्रा या गतिविधि बढ़ने से ऊर्जा व्यय में वृद्धि होती है और इंसुलिन संवेदनशीलता में सुधार होता है। मनुष्यों में, पता लगाने योग्य बीएटी वाले लोगों में कार्डियोमेटाबोलिक रोगों का काफी कम प्रसारहोता है। इस प्रकार, बीएटी मोटापे से संबंधित चयापचय अनुक्रम 7,8,9 के लिए उत्कृष्ट चिकित्सीय क्षमता रखता है।
बीएटी विकास और कार्य के शरीर विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी की जांच करने और इन प्रक्रियाओं में शामिल आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, बीएटी-विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पसंद10 की एक विधि है। क्रे-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली माउस जीनोम को संपादित करके सशर्त नॉकआउट चूहों का उत्पादन करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला साधन है। इस प्रणाली ने ऊतक/कोशिका-विशिष्ट तरीके से रुचि के जीनों के संशोधन (ओवरएक्प्रेशन या नॉकआउट) को सक्षमकिया है। इसका उपयोग चयनात्मक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन को व्यक्त करके एक विशिष्ट सेल प्रकार को लेबल करने के लिए भी किया जा सकता है।
हाल ही में, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 तकनीक और एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) सिंगल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) सिस्टम12 के संयोजन से सीआरई-लोक्सपी सिस्टम दृष्टिकोण को और विकसित किया गया है। CRISPR-Cas9 प्रणाली जीनोम13 के सटीक क्षेत्रों को संशोधित, विनियमित या लक्षित करने के लिए एक विशिष्ट और कुशल जीन-संपादन उपकरण है। CRISPR-Cas9-आधारित जीनोम संपादन जीनोमिक लोकी के तेजी से आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देता है क्योंकि इसे जीन-लक्ष्यीकरण वेक्टर के साथ समरूप पुनर्संयोजन की आवश्यकता नहीं होती है। संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-कैस 9, और एएवी-एसजीआरएनए तकनीक शोधकर्ताओं को ऊतकों / कोशिकाओं में वांछित समय पर रुचि के जीन की भूमिका की जांच की अनुमति देकर जीन कार्यों को अधिक सटीक रूप से समझने में सक्षम बनाती है। इसके अतिरिक्त, ये संयुक्त तकनीक ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय और प्रयास को कम करती हैं और चूहों में इंड्यूसेबल जीनोम संपादन के लिए सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 गतिविधि के अस्थायीनियंत्रण की अनुमति देती हैं यदि एक इंड्यूसेबल सीआरई लाइन का उपयोग किया जाता है।
एएवी वैक्टर विवो जीन वितरण प्रणालियों में सुरक्षित और प्रभावी हैं। हालांकि, वसा ऊतक को लक्षित करने वाले एएवी मस्तिष्क, हृदय, यकृत और मांसपेशियों15 जैसे अन्य ऊतकों में अनुप्रयोगों से पीछे रह गए हैं। स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले सीरोटाइप वैक्टर के साथ अपेक्षाकृत कम पारगमन दक्षता और ट्रोपिज्म के कारण, वसा ऊतक के लिए एएवी-निर्देशित जीन वितरण अभीभी चुनौतीपूर्ण है। पिछले 5 वर्षों में, हमने और अन्य लोगों ने वसा ऊतक में एएवी-निर्देशित जीन वितरित करने के लिए प्रभावी और न्यूनतम इनवेसिव तरीके सफलतापूर्वक स्थापित किए हैं और माउस मॉडल बनाए हैं जो हमें बीएटी फ़ंक्शन 16,17,18,19 के विनियमन में शामिल जीन की समझ हासिल करने की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, एएवी 8 का उपयोग करके एलोक्स 12 को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए को वितरित करने के लिए, जो यूसीपी 1-सीआरई / सीएएस 9 चूहों के बीएटी में 12-लिपोक्सीजिनेज (12-एलओएक्स) को एन्कोड करता है, हमने पाया है कि सक्रिय बीएटी 12-एलओएक्स मेटाबोलाइट्स का उत्पादन करता है, अर्थात् 12-हाइड्रॉक्सी-इकोसापेंटेनोइक एसिड (12-एचईपीई) और13 आर, 14 एस-डाइहाइड्रॉक्सी डोकोसाहेक्साएनोइक एसिड (मार्सिन 2) को विनियमित करने के लिए। 17. यहां, हम तकनीकी प्रक्रियाओं पर एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, विशेष रूप से बीएटी लोब में एएवी-एसजीआरएनए के प्रत्यक्ष माइक्रोइंजेक्शन के लिए सर्जरी, संयुक्त क्रे-लोक्सपी, सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9 और एएवी-एसजीआरएनए प्रणाली का उपयोग करके बीएटी-विशिष्ट नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
इंटरस्केपुलर बीएटी में एएवी-मध्यस्थता जीन वितरण के लिए मौजूदा प्रकाशित तरीकों में सर्जिकल तकनीकों और बीएटी में प्रत्यक्ष एएवी इंजेक्शन के दृष्टिकोण का वर्णन करने वाले विस्तृत चित्र और वीडियो शामिल…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) अनुदान आर01डीके122808, आर01डीके102898, और आर01डीके132469 (वाई-एचटी को), साथ ही पी 30डीके036836 (जोसलिन डायबिटीज सेंटर के डायबिटीज रिसर्च सेंटर को) द्वारा समर्थित किया गया था। टी टी को सनस्टार रिसर्च फैलोशिप (हीरू कनेडा छात्रवृत्ति, सनस्टार फाउंडेशन, जापान) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 903968 द्वारा समर्थित किया गया था। वाई जेड चार्ल्स ए किंग ट्रस्ट फैलोशिप द्वारा समर्थित था। हम पांडुलिपि को प्रमाणित करने के लिए शॉन डी कोडानी को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
