결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성
Summary
이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.
Abstract
갈색 지방 조직(BAT)은 생리 활성 분자의 분비를 통해 내분비 기관 역할도 할 수 있는 에너지 소산에 특화된 지방 저장소입니다. BAT 특이적 녹아웃 마우스의 생성은 BAT 매개 에너지 조절에 대한 관심 유전자의 기여를 이해하기 위한 가장 인기 있는 접근 방식 중 하나입니다. Cre-LoxP 시스템을 활용한 기존의 유전자 표적화 전략은 조직 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 주요 접근 방식이었습니다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고 지루합니다. 여기에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 사용하여 BAT에서 관심 유전자를 빠르고 효율적으로 녹아웃하기 위한 프로토콜을 설명합니다. interscapular BAT는 근육 사이의 깊은 층에 위치합니다. 따라서 AAV를 시야 내에서 BAT에 정확하고 직접 주입하기 위해서는 BAT가 노출되어야 합니다. 적절한 외과적 치료는 BAT에 연결되는 Sultzer의 정맥과 같은 교감 신경 및 혈관의 손상을 방지하는 데 중요합니다. 조직 손상을 최소화하기 위해서는 BAT의 3차원 해부학적 위치와 기술 단계에서 요구되는 수술 기술을 이해하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 관심 유전자를 표적으로 하는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비, BAT에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 광범위하게 적용될 수 있는 BAT 특이적 녹아웃 마우스를 생성하기 위해 두 BAT 로브에 AAV를 직접 미세주입하는 수술을 포함한 주요 기술 절차를 강조합니다.
Introduction
비만은 전 세계적으로 상당한 속도로 증가하고 있으며, 이는 광범위한 대사 질환으로 이어진다 1,2,3. 지방 조직은 이러한 병리의 핵심입니다. 존재하는 두 가지 기능적으로 구별되는 유형의 지방 조직은 과도한 칼로리를 저장하는 백색 지방 조직(WAT)과 열 생성을 위해 에너지를 발산하는 갈색 지방 조직(BAT) 및 관련 베이지색/브라이트 지방입니다. BAT는 에너지 소산 기능으로 인정 받았지만 원위 기관의 신진 대사를 조절하는 생리 활성 분자의 생산을 통한 내분비 기능도 가지고 있습니다 4,5. 설치류에 대한 수많은 연구에서 갈색 또는 베이지색 지방의 양이나 활성을 증가시키면 에너지 소비가 증가하고 인슐린 감수성이 향상된다는 사실이 입증되었습니다. 인간의 경우, BAT가 검출되는 사람은 심혈관 질환의 유병률이 현저히 낮다6. 따라서, BAT는 비만 관련 대사 후유증에 대한 우수한 치료 가능성을 보유한다 7,8,9.
BAT 발달 및 기능의 생리학 및 병태생리학을 조사하고 이러한 과정에 관여하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 BAT 특이적 형질전환 마우스 모델을 선택하는 방법10. Cre-LoxP 재조합 시스템은 마우스 게놈을 편집하여 조건부 녹아웃 마우스를 생산하는 데 가장 일반적으로 사용되는 수단입니다. 이 시스템은 조직/세포 특이적 방식으로 관심 유전자의 변형(과발현 또는 녹아웃)을 가능하게 했다11. 또한 선택적 형광 리포터 유전자를 발현하여 특정 세포 유형을 표지하는 데 사용할 수 있습니다.
최근에, Cre-LoxP 시스템 접근법은 CRISPR-Cas9 기술과 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템(12)을 결합하여 더욱 발전되었다. CRISPR-Cas9 시스템은 게놈13의 정확한 영역을 수정, 조절 또는 표적화하기 위한 구체적이고 효율적인 유전자 편집 도구입니다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집은 유전자 표적 벡터와 상동 재조합이 필요하지 않기 때문에 게놈 유전자좌의 신속한 유전자 조작이 가능합니다. Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 AAV-sgRNA 기술을 결합하면 조직/세포에서 원하는 시간에 관심 유전자의 역할을 조사할 수 있으므로 연구자가 유전자 기능을 보다 정확하게 이해할 수 있습니다. 또한, 이러한 결합된 기술은 형질전환 마우스를 생성하는 데 필요한 시간과 노력을 줄이고 유도성 Cre 라인을 사용하는 경우 마우스에서 유도성 게놈 편집을 위한 CRISPR-Cas9 활성의 시간적 제어를 허용합니다14.
AAV 벡터는 안전하고 효과적인 생체 내 유전자 전달 시스템입니다. 그러나 지방 조직을 표적으로 하는 AAV는 뇌, 심장, 간, 근육과 같은 다른 조직에서의 응용에 뒤쳐져 있다15. 상대적으로 낮은 형질도입 효율과 자연적으로 발생하는 혈청형 벡터의 친화성으로 인해 지방 조직으로의 AAV 유도 유전자 전달은 여전히 어려운과제입니다 15. 지난 5년 동안 우리와 다른 사람들은 AAV 유도 유전자를 지방 조직으로 전달하는 효과적이고 최소 침습적인 방법을 성공적으로 확립했으며 BAT 기능 조절에 관여하는 유전자를 이해할 수 있는 마우스 모델을 만들었습니다16,17,18,19. 예를 들어, AAV8을 사용하여 12-리폭시게나제(12-LOX)를 암호화하는 Alox12를 표적으로 하는 sgRNA를 Ucp1-Cre/Cas9 마우스의 BAT에 전달함으로써, 활성화된 BAT가 12-LOX 대사산물, 즉 12-하이드록시-에이코사펜타엔산(12-HEPE) 및 13R, 14S-디하이드록시도코사헥사엔산(maresin 2)을 생성하여 각각 포도당 대사를 조절하고 비만 관련 염증을 해결한다는 것을 발견했습니다16, 17. 여기에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 AAV-sgRNA 시스템을 사용하여 BAT 특이적 녹아웃 마우스를 생성하기 위한 기술 절차, 특히 BAT 로브에 AAV-sgRNA를 직접 미세주입하는 수술에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
견갑간 BAT에 대한 AAV 매개 유전자 전달을 위해 기존에 발표된 방법에는 BAT에 AAV를 직접 주입하기 위한 수술 기술과 접근 방식을 설명하는 자세한 사진과 비디오가 포함되어 있지 않습니다. 공개된 대부분의 방법(33,34)에서, AAV는 BAT 자체 대신에 견갑간 BAT를 둘러싼 지방 조직에 주입된다. 따라서 이 프로토콜에는 연구의 성공을 결정하는 몇 가지 주요 단…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 미국 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01DK122808, R01DK102898 및 R01DK132469 (Y.-HT에)와 P30DK036836 (Joslin Diabetes Center의 당뇨병 연구 센터에)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. T.T.는 SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan)과 미국 심장 협회 (American Heart Association) 보조금 903968의 지원을 받았습니다. Y. Z.는 Charles A. King Trust Fellowship의 지원을 받았습니다. 원고를 친절하게 교정해 주신 Sean D. Kodani에게 감사드립니다.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
